與結(jié)球甘藍(lán)耐抽薹基因相連鎖的分子標(biāo)記及其獲得方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種與結(jié)球甘藍(lán)度rassicaoleracea L.var.capitataL.)耐抽臺基因連鎖的分子標(biāo)記B0ISSROO207及其獲得方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘藍(lán)為蕓臺屬"UΞ角"作物含CC二倍體基因組的基本種，包括結(jié)球甘藍(lán)、花挪菜、 青花菜、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)和芥藍(lán)等8個(gè)栽培變種。各變種間天然 雜交率很高。甘藍(lán)類蔬菜目前在世界各地廣泛栽培，W結(jié)球甘藍(lán)栽培面積最大，結(jié)球甘藍(lán)、 花挪菜、青花菜和球莖甘藍(lán)在中國普遍栽培，芥藍(lán)主要在我國華南地區(qū)等地栽培。據(jù)報(bào)道， 2013年我國結(jié)球甘藍(lán)年種植面積大約為90萬hm2;青花菜種植面積約8萬hm2;花挪菜種植 面積45萬hm2。
[0003] 結(jié)球甘藍(lán)是我國重要的蔬菜作物之一，在各地普遍栽培，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)與周 年供應(yīng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其栽培面積約占我國蔬菜播種面積的10%W上，在我國城鄉(xiāng)蔬菜供應(yīng)中具 有舉足輕重的地位。在春甘藍(lán)栽培中，往往因氣候及栽培管理不當(dāng)?shù)仍蛟斐纱焊仕{(lán)發(fā)生 先期抽臺現(xiàn)象，從而嚴(yán)重影響結(jié)球甘藍(lán)的品質(zhì)和產(chǎn)量，給生產(chǎn)帶來巨大損失。因此，為有效 減少運(yùn)些損失，需要在理論上加強(qiáng)結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺性分子遺傳機(jī)制的研究，同時(shí)，在生產(chǎn)上 培育具有耐抽臺性的甘藍(lán)品種。
[0004] 為解決上述影響我國十字花科作物可持續(xù)發(fā)展的重大問題，挖掘新的耐抽臺種質(zhì) 資源，W往育種家們大多借助形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記來輔助育種，經(jīng)篩選已獲得一些優(yōu)良 的耐抽臺自交系，但在耐抽臺性轉(zhuǎn)育過程中應(yīng)用傳統(tǒng)的方法篩選耐抽臺植株時(shí)存在選育時(shí) 間較長、操作程序繁瑣等缺點(diǎn)；另一方面耐抽臺性的表現(xiàn)易受環(huán)境條件的影響，難W適應(yīng)育 種實(shí)踐的需要。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)開展十字花科蔬菜 耐抽臺性育種顯出巨大的潛力。一類基于DNA變異的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被國內(nèi)外許多學(xué) 者應(yīng)用于十字花科蔬菜抗逆及抗病研究。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)，不但可W免除傳統(tǒng)育種中繁 重的選擇過程，W及跟蹤、檢測外源基因，還能把多個(gè)抗病及抗逆基因聚合到同一優(yōu)良品種 中，使其獲得持久、廣泛的抗性。
[0005] 提高耐抽臺性是當(dāng)前結(jié)球甘藍(lán)乃至整個(gè)十字花科蔬菜重要的育種目標(biāo)之一。同 時(shí)，通過雜交與回交技術(shù)，可W將結(jié)球甘藍(lán)中的耐抽臺基因轉(zhuǎn)移到同為甘藍(lán)種的青花菜、花 挪菜、抱子甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)和芥藍(lán)等變種中，從而為耐抽臺的甘藍(lán)類蔬菜新品種選育提供基 因資源。因此，獲得與耐抽臺基因緊密連鎖的分子標(biāo)記不僅可應(yīng)用到分子輔助育種中，提高 甘藍(lán)種作物耐抽臺育種效率，在品種選育上有重要的應(yīng)用價(jià)值，還可W為進(jìn)一步圖位克隆 耐抽臺基因并分析其生物學(xué)功能奠定研究基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有在育種實(shí)踐中可用的耐抽臺分子標(biāo)記不足，提供一種 與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因連鎖的分子標(biāo)記BO1SSR00207及其獲得方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因相連鎖的 分子標(biāo)記，其上游引物為SEQIDNO. 1，下游引物為SEQIDNO. 2。
[0008] -種與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因相連鎖的分子標(biāo)記的獲得方法，包括W下步驟：
[0009] (1)利用經(jīng)過多代自交選育出的耐抽臺材料叩9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，將 耐抽臺親本和易抽臺親本進(jìn)行雜交得到Fi群體，F(xiàn)1自交后獲得F2群體；
[0010] 似針對F2群體，采用改良的BSA法分別構(gòu)建耐抽臺基因池和易抽臺基因池；
[0011] (3)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對易抽臺基因池和耐抽臺基因池進(jìn)行與結(jié)球甘 藍(lán)耐抽臺性分子標(biāo)記的篩選；篩選出與目標(biāo)性狀（耐抽臺性）存在連鎖關(guān)系分子標(biāo)記 BO1SSR00207,經(jīng)單株驗(yàn)證分析，該分子標(biāo)記BO1SSR00207與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因的遺傳距 離為 10. 69cM。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟2具體為：
[0013](2. 1)通過冬性鑒定確定F2群體中每一個(gè)單株的耐抽臺性，W抽臺情況將F2代群 體單株分為1級~9級。其中，1級為：短縮莖伸長（< 1cm) ;9級為：花臺大于20cm;
[0014] (2. 2)取F2代群體中的1級單株15株，采用CTAB法提取基因組DM,混樣后構(gòu)建 F2代易抽臺基因池；取9級單株15株，采用CTAB法提取基因組DNA，混樣后構(gòu)建F2代耐抽 臺基因池。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 先期抽臺嚴(yán)重影響結(jié)球甘藍(lán)乃至十字花科蔬菜的品質(zhì)與產(chǎn)量，給生產(chǎn)帶來巨大的 損失。本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記方法，結(jié)合改良的BSA法得到一個(gè)與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因 連鎖的SSR分子標(biāo)記，可直接用于甘藍(lán)類蔬菜的耐抽臺性分子標(biāo)記的輔助選擇育種。利用 該分子標(biāo)記，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時(shí)間周期長等缺點(diǎn)，還可W有目的地聚合多個(gè) 抗性基因，培育出具有穩(wěn)定的多抗性的甘藍(lán)類蔬菜新品種。同時(shí)也可利用運(yùn)個(gè)新的與耐抽 臺基因連鎖的分子標(biāo)記克隆結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，運(yùn)對于進(jìn) 一步了解結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺的分子遺傳機(jī)理有積極意義。因此，本發(fā)明在甘藍(lán)類蔬菜育種實(shí) 踐及耐抽臺理論研究上均具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1為雙親及Fi代田間植株。其中，A:母本，B:Fi代，C:父本。
[0018] 圖2為BO1SSR00207引物對耐/易抽臺基因池的擴(kuò)增結(jié)果。1~3:耐抽臺基因 池；4~6 :易抽臺基因池。Μ為lOObpDNAmarker。
[0019] 圖3為B0ISSROO207引物對兩個(gè)親本的驗(yàn)證結(jié)果。Pi為父本，P2為母本，Μ為10化p DNAm曰rker〇
[0020] 圖4為B0ISSROO207引物的F2代單株驗(yàn)證結(jié)果。Μ為lOObpDNAmarker。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺分子標(biāo)記BO1SSR00207的獲得方法主要包括W下步驟：
[0022] 1.利用經(jīng)多代自交選育出的耐抽臺材料'Y9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，將所 述耐/易抽臺親本雜交得到Fi群體，F(xiàn)1自交獲得F2群體。
[0023] 2.應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用改良BSA法進(jìn)行與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺性分子標(biāo)記的 篩選。
[0024] (1)葉片總DM的提取：
[00巧]具體做法為：通過冬性鑒定確定每一個(gè)單株的耐抽臺性，W抽臺情況將F2代群體 單株分為1級~9級分別取樣。其具體標(biāo)準(zhǔn)為：1級：短縮莖伸長（< 1cm) ;3級：短縮莖伸 長明顯（1~2cm)，無花臺；5級：短縮莖伸長，有花臺（< 5cm) ;7級：節(jié)間伸長，花臺大于 5cm;9級：節(jié)間伸長，花臺高度大于20畑1。采用CTAB法提取基因組DNA。同時(shí)還提取了親 本Pi和P2的基因組DM。
[0026] 似耐/易抽臺結(jié)球甘藍(lán)基因池的構(gòu)建
[0027] 具體做法為：本發(fā)明采用改良的BSA法分別構(gòu)建耐抽臺基因池和易抽臺基因池。 從F2代群體中1級單株和9級單株各取15株基因組DNA分別進(jìn)行混樣，構(gòu)建F2代易抽臺 基因池及F2代耐抽臺基因池。
[0028] (3)與結(jié)球甘藍(lán)耐抽臺基因連鎖的SSR標(biāo)記的篩選
[002引利用336對SSR引物（序列見表1)對2個(gè)基因池化代耐抽臺池和F 2代易抽臺 池）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一PCR重復(fù)一次。PCR檢測的反應(yīng)體系（20μ? :75ng基因組DNA模 板，0. 5U Taq DNA聚合酶（FermentasTM)、0. 4μL (10μmol·L1)dNTPs、1μL (10μmol·L1) 上下游引物、2μΙ lOXPCR Buffer(200mmol.LiTris pH 8.0,200mmol.LiKCl， lOOmmol .L i(NH4)2S04和20mmol .L iM拆04)，加(1地20至20yL。PCR檢測的擴(kuò)增程序：94°C 預(yù)變性3min，進(jìn)入35個(gè)循環(huán)（94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)，最后再72°C延 伸7min。PCR反應(yīng)過程在BIO-RAD S1000 ? Thermal切cler儀器上進(jìn)行，樣品在4°C條件 下保存。
[0030] 表1用于篩選SSR標(biāo)記的引物序列
[0031]
[0032]







[0040]PCR產(chǎn)物用12%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的聚丙締酷胺凝膠電泳檢測。PAGE電泳及染色所用試 劑和儀器如下：
[00川（3.1)0.3g/血的丙締酷胺混合液（100血）（即30%質(zhì)量百分比的膠原液），配制方 法為：29g丙締酷胺（Ac巧lamide)，Ig N, Ν'-甲雙丙締酷胺（Bisac巧lamide)，加d地20至 100mL，37°C攬拌溶解，4°C避光保存。
[004引 （3.。0.Ig/mL的過硫酸胺（10血），配制方法為：Ig過硫酸胺（Ammonium persulfate,AP巧溶于10血d地20中，4°C保存。
[0043] (3. 3)5ΧΤ邸緩沖液（pH8. 3,500血），配制方法為：27gTris堿，13. 75g棚酸， 1. 86g胞2邸ΤΑ· &0,加d地2〇定容到500血，4°C保存。
[0044] (3. 4)TEMED(N，，N，，N，，N，-四甲基乙二胺）。
[0045] (3. 5)上樣緩沖液：其中含有0. 25%漠酪藍(lán)（W/V)，40%薦糖水溶液（W/V)，4°C膽 存。
[004引（3. 6)封底膠：1 %瓊脂糖溶液，用1XT邸配置。
[0047] (3. 7)染色液：無水乙醇50ml，硝酸銀0. 5g，溶于dd&0并定容至500ml。膽存于 棟色瓶中，室溫保存。
[0048] (3. 8)顯色液：氨氧化鋼lOg，溶于dd&0并定容至500ml，室溫保存。實(shí)驗(yàn)室再加 入2ml質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為37%的甲醒。
[0049](3. 9)儀器：DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），DYCZ-30C型雙夾板垂 直電泳槽（北京六一儀器廠），Tanon2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)等。
[0050]PAGE電泳的主要步驟：
[0051] 1)將準(zhǔn)備灌膠的玻璃板，梳子，膠套，電泳槽等，用去污劑洗涂自來水沖洗，驚干， 酒精擦拭。
[0052] 2)將兩塊玻璃板插入橡膠套后，放入電泳槽中，使較低的玻璃板朝向負(fù)極（黑色 電極）。保持電泳槽水平，梓緊電泳槽上的螺桿使玻璃板和橡膠套穩(wěn)固且密封。
[0053] 3)在微波爐中將封底膠煮沸，將玻璃板和橡膠套Ξ面的外側(cè)接縫封好