一株高效積累多聚磷酸鹽的積磷小月菌工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株高效積累多聚憐酸鹽的積 憐小月菌工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前水體富營(yíng)養(yǎng)化問題相當(dāng)嚴(yán)重，研究證實(shí)憐是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵因子之 一，因此降低污水處理廠出水中的憐元素含量是控制水體富營(yíng)養(yǎng)化的一項(xiàng)重要措施。目前 污水處理廠普遍采用增強(qiáng)型生物除憐系統(tǒng)巧nhancebiologicalphosphorusremoval, EBPR)作為首選的生物除憐技術(shù)。邸PR生物除憐功能的實(shí)現(xiàn)依賴于活性污泥中聚憐微生物 的聚憐作用，聚憐微生物是一類可W合成多聚憐酸鹽的微生物總稱，具有過量吸收水體中 可溶性憐并W多聚憐酸鹽形式儲(chǔ)存在菌體的特點(diǎn)。
[000引積憐小月菌（Microluna化Sphosphovorus)是聚憐微生物的一個(gè)代表，其積累的 多聚憐酸鹽任oly-巧能達(dá)到菌體干重的10%W上，在邸PR系統(tǒng)中具有很好的除憐效果。但 是與其他聚憐微生物一樣，積憐小月菌存在一個(gè)合成和分解多聚憐酸鹽的循環(huán)，即在好氧 的時(shí)候合成多聚憐酸鹽，在厭氧的時(shí)候分解多聚憐酸鹽W獲得能量，維持菌體對(duì)GTP和ATP 的需求。積憐小月菌的運(yùn)種特性影響了其在邸PR中的作用，特別是當(dāng)邸PR系統(tǒng)出現(xiàn)供氧 不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致出水總憐含量不能達(dá)到法定的排放標(biāo)準(zhǔn)。因此，開發(fā)一種在厭氧條件下分解 多聚憐酸鹽能力大幅度降低的積憐小月菌具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 多聚憐酸鹽激酶PPK2是催化積憐小月菌化ly-P和ATP/GTP之間可逆反應(yīng)的關(guān)鍵 酶。好氧條件下細(xì)胞能量充足，PPK2在ATP/GTP的驅(qū)動(dòng)下將可溶性憐催化合成化ly-P，厭 氧條件下PPK2催化化ly-P分解形成ATP/GTP，維持細(xì)胞的核巧酸庫平衡，滿足細(xì)胞的正常 生長(zhǎng)需求。PPK2的特殊作用決定了不能采用失活ppk2基因的方式對(duì)積憐小月菌進(jìn)行改造， 目前也尚未有關(guān)于通過改造ppk2基因啟動(dòng)子而獲得高性能積憐小月菌的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株高效積累多聚憐酸鹽的積憐小月菌 工程菌及其應(yīng)用。通過改造ppk2基因的啟動(dòng)子，減弱低氧條件對(duì)ppk2基因的活化作用，降 低ppk2的表達(dá)水平，減少PPK2對(duì)化ly-P的分解，最終改善積憐小月菌積累化ly-P的性能。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種經(jīng)定向改造的ppk2基因啟動(dòng)子，其具有如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)堿基形成的具有同等功 能的核巧酸序列。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)及該啟動(dòng)子在低氧條件下降低ppk2表達(dá)水平中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的還一方面設(shè)及一種積憐小月菌，其含有上述經(jīng)定向改造的ppk2基因啟 動(dòng)子。
[0010] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一株高效積累多聚憐酸鹽的積憐小月菌工程菌，該菌株具 體為積憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovo;rus)JN459-M571。已于 2015 年 12 月 1 日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏編號(hào)為CGMCCNO. 11770。 |；0〇11] 本發(fā)明的積憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovorus)JN459-M571與野生型積憐小 月菌JN459相比，卵k2基因啟動(dòng)子有3個(gè)堿基的變化，分別是-46位、-76位和-79位堿基 都由G變成A。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為積憐小月菌 (Microlunatusphosphovorus)JN459-M571〇
[0013] 所述積憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovorus)JN459-M571和/或所述菌劑在制 備生物除憐劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 本發(fā)明還一個(gè)目的是提供一對(duì)用于定向改造（即體外突變）ppk2基因啟動(dòng)子的易 錯(cuò)PCR的引物，其引物序列分別如序列表中SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。 陽〇1引本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該積憐小月菌（Microluna化Sphosphovorus)JN459-M571的制備方法，采用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外對(duì)ppk2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行突變，W 已有的積憐小月菌JN459為出發(fā)菌，通過同源重組技術(shù)建立含有ppk2基因突變啟動(dòng)子 的菌株庫，測(cè)定好氧和厭氧運(yùn)行條件下化ly-P含量的變化，篩選得到高性能積憐小月菌 JN459-M571。
[0016]上游引物卵k2ProForward序列：GTCGAAATGTCGGAAGCCGTGC(沈Q IDNO. 2);
[0017]下游引物卵k2ProReverse序列：TAACCCATTGTTCGCCCGGCAG(SEQ IDNO. 3)。
[0018] 所述連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外突變ppk2基因啟動(dòng)子的具體方法為：
[0019] (1)PCR反應(yīng)體系：模板DNA2ul、PCR緩沖液加1、TaqDNA聚合酶lul、dATP 1~3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化l、25mM MgClz!~8ul、5mMMnClzO~lul,補(bǔ)加超純水至 50ul。 W20] 似PCR條件：預(yù)變性95°C5分鐘，變性95°C30秒，退火52~60°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環(huán)30次，終延伸8分鐘。
[0021] 第1次PCR的模板DNA來源于積憐小月菌JN459,第2次PCR及后續(xù)PCR的模板 DNA采用上次PCR產(chǎn)物。
[0022] 所述含有ppk2基因突變啟動(dòng)子的菌株庫的構(gòu)建方法，具體步驟如下：
[0023] (1)首先構(gòu)建攜帶ppk2基因上下游同源臂的穿梭載體PMV30服，然后將連續(xù)易 錯(cuò)PCR產(chǎn)物用凝膠瓊脂糖電泳分離后回收PCR產(chǎn)物，與上述穿梭載體PMV30服在Gibson CloningMasterMix作用下進(jìn)行體外重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a,挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行 雙酶切鑒定；
[0024] (2)采用電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組PMV30服質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JN459菌株，在同源重組作用下得 到一系列轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建含ppk2基因啟動(dòng)子突變體的菌株庫。
[00巧]本發(fā)明的有益效果：
[00%] (1)本發(fā)明首次采用定向突變的方式篩選多聚憐酸鹽激酶ppk2基因啟動(dòng)子的 突變體，同時(shí)通過檢測(cè)好氧和厭氧運(yùn)行條件下Poly-P含量變化獲得高性能積憐小月菌JN459-M571，其厭氧條件運(yùn)行24小時(shí)后化ly-P含量比野生型菌株高2. 4倍，可應(yīng)用于污水 處理廠的邸PR生物除憐工藝，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
[0027] 似本發(fā)明采用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外突變多聚憐酸鹽激酶ppk2的啟動(dòng)子序列， 減弱了低氧條件對(duì)ppk2基因的活化作用，降低了ppk2的表達(dá)水平，減少了PPK2對(duì)化ly-P 的分解，最終改善了積憐小月菌積累化ly-P的性能。
[0028] (3)本發(fā)明的積憐小月菌JN459-M571在厭氧條件下化ly-P分解速度大幅度降低， 而好氧條件下合成化ly-P性能無顯著差異。
[0029] (4)本發(fā)明的積憐小月菌工程菌的制備方法，突變工作的效率高，針對(duì)性非常強(qiáng)， 降低了誘變育種的隨機(jī)性和盲目性，符合微生物菌種的育種需要。
【附圖說明】
[0030] 圖1 :好氧和厭氧運(yùn)行條件下對(duì)污水中可溶性憐的去除效果；
[0031] 圖2 :好氧和厭氧運(yùn)行條件下化ly-P含量變化。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0033] 實(shí)施例1 :連續(xù)易錯(cuò)PCR獲得含突變堿基的ppk2啟動(dòng)子
[0034] 采用連續(xù)易錯(cuò)PCR在體外對(duì)ppk2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行突變。具體為： 陽03引 1.易錯(cuò)PCR的引物為：
[0036]上游引物卵k2ProForward序列：GTCGAAATGTCGGAAGCCGTGC(沈QIDNO. 2);
[0037]下游引物卵k2ProReverse序列：TAACCCATTGTTCGCCCGGCAG(SEQIDNO. 3)。 陽03引 （1)PCR反應(yīng)體系：模板DNA2ul、PCR緩沖液加1、TaqDNA聚合酶lul、dATP 1~3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化l、25mM MgClz!~8ul、5mMMnClzO~lul,補(bǔ)加超純水至 50ul。 W39] 似PCR條件：預(yù)變性95°C5分鐘，變性95°C30秒，退火52~60°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環(huán)30次，終延伸8分鐘。
[0040] 第1次PCR的模板DNA來源于積憐小月菌JN459,第2次PCR及后續(xù)PCR的模板 DNA采用上次PCR產(chǎn)物。
[0041] PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序，結(jié)果顯示：當(dāng)PCR體系中dATP3ul、dTTP3ul、dGTPlul、 dCTPlul、上游引物化1、下游引物化l、25mMMgCl23ul、5mMMnClzO.加1，PCR退火溫度為 56 °C，3次連續(xù)PCR時(shí)錯(cuò)配堿基數(shù)為3~6，突變頻率比較適合進(jìn)行定向改造。
[0042] 實(shí)施例2 :積憐小月菌ppk2基因啟動(dòng)子的突變體庫構(gòu)建
[0043] 構(gòu)建攜帶ppk2基因上下游同源臂的穿梭載體PMV30服，將實(shí)施例1中的連續(xù)易 錯(cuò)PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離后回收PCR產(chǎn)物，與上述穿梭載體PMV30服在Gibson CloningMasterMix作用下進(jìn)行體外重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a,挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行 雙酶切鑒定（PMV30服為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)質(zhì)粒）。
[0044] 按下列配方配制液體培養(yǎng)基：葡萄糖0. 5g、蛋白腺0. 5g、酵母粉0. 5g、谷氨酸 鋼0. 5g、硫酸錠0.Ig、憐酸氨二鐘0. 44g、硫酸儀0.Ig、純化水比，抑7. 0,0. 15MPa滅菌 30min。每250mlΞ角瓶裝