一種構(gòu)建高產(chǎn)丁醇菌株的方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種構(gòu)建高產(chǎn)下醇菌株的方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源與環(huán)境是當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著化石能源的日漸枯竭和自然環(huán)境的污 染，人類對(duì)可再生能源的需求越來越強(qiáng)烈。利用微生物轉(zhuǎn)化或發(fā)酵可再生資源高效生產(chǎn)可 再生能源是今后的能源發(fā)展趨勢(shì)，運(yùn)種通過生物法生產(chǎn)化學(xué)品的方式是可持續(xù)的且環(huán)境友 好的。
[0003] 下醇是一種重要的化工品和原料，可直接用作有機(jī)溶劑，是合成多種醋類化合物 的前體，廣泛應(yīng)用于各種塑料和橡膠制品中。同時(shí)，下醇也是優(yōu)良的可替代汽油的生物燃 料。它具有和汽油相當(dāng)?shù)臒嶂蹬c辛燒值，可與汽油W任意比例混合；在運(yùn)輸過程中，不易腐 蝕管道；與乙醇相比，其蒸汽壓低，安全性高，因此是一種極具潛力的新型生物燃料。目前， 下醇的年市場(chǎng)需求大約在百萬噸級(jí)別。
[0004] 下醇可由生物合成是己斯德于1861年首次發(fā)現(xiàn)的。1912年，魏茲曼（Weizmann) 發(fā)現(xiàn)了一種梭菌Clostridiumacetobut^ixum(丙酬下醇梭菌）能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為丙酬、 下醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酬下醇梭菌，W期得到可用于工業(yè)化生產(chǎn)下醇 的工程菌株。但是，丙酬下醇梭菌是一種嚴(yán)格厭氧生長的革蘭氏陽性細(xì)菌，其遺傳操作系統(tǒng) 復(fù)雜，不利于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的研究和工業(yè)的生產(chǎn)。2008年，化otaAtsumi,JamesC.Liao等 首先在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了下醇的合成（AtsumiS,CannAF,ConnorΜR,etal.Met油olic engineeringofEscherichiacolifor1-butanolproduction.Metabolicengineer! ng，2008, 10化）：305-311.)，該研究組將丙酬下醇梭菌體內(nèi)的下醇合成途徑轉(zhuǎn)移至大腸桿 菌內(nèi)，致使其可產(chǎn)生少量下醇。隨后，該研究組對(duì)整條途徑進(jìn)行了優(yōu)化，將WNADH為還原 力，催化可逆反應(yīng)己豆酷輔酶A生成下酷輔酶A的下酷輔酶A脫氨酶復(fù)合物度cd-EtfAB complex)替換為來自齒垢密螺旋體（Treponemadenticola)的催化不可逆反應(yīng)的反式締 酷輔酶A還原酶（Ter);催化乙酷輔酶A生成乙酷乙酷輔酶A的酶，由乙酷乙酷輔酶A硫解 酶帥1)換為大腸桿菌中活性更強(qiáng)的乙酷輔酶A乙酷轉(zhuǎn)移酶（AtoB)，由此形成了NA畑和乙 酷輔酶A的驅(qū)動(dòng)力，下醇產(chǎn)量大幅度提高。
[0005] 目前，在提高大腸桿菌產(chǎn)下醇方面，多數(shù)研究集中于改造來自丙酬下醇梭菌的下 醇途徑，但運(yùn)并不是唯一的策略。下醇途徑是與糖酵解禪聯(lián)的，除下醇途徑外，基因組上可 能仍存在多個(gè)有利于下醇生產(chǎn)的祀點(diǎn)，而關(guān)于此類祀點(diǎn)的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，為抑制或沉默生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌的基因組上的丙酬酸激酶 pykA基因表達(dá)，得到重組菌。
[0008] 上述方法中，所述抑制或沉默生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的丙酬酸激酶pykA基 因表達(dá)為敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的丙酬酸激酶pykA基因。
[0009] 上述方法中，所述敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的丙酬酸激酶pykA基因采用 入-red同源重組系統(tǒng)、sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組或CRISPR/Cas系統(tǒng)。優(yōu)先采用λ-red 同源重組系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)施。
[0010] 上述方法中，所述敲除生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的丙酬酸激酶pykA基因?yàn)椴?用λ-red同源重組系統(tǒng)將生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌基因組上的丙酬酸激酶pykA基因替換為 FRT(Flp重組酶識(shí)別祀點(diǎn)序列）；
[0011] 所述FRT的核巧酸序列為序列5第59-106位。
[0012] 上述方法中，所述生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為大腸桿菌 BW25113 或其突變體邸216CGMCCNo. 11590。
[0013] 上述方法中，所述丙酬酸激酶pykA的氨基酸序列為序列表中序列1。
[0014] 上述方法中，所述丙酬酸激酶pykA基因pykA的核巧酸序列為序列3。
[0015] 上述方法中，所述抑制或沉默大腸桿菌邸216基因組上的丙酬酸激酶基因表達(dá)包 括如下步驟：
[0016] 1)將含有丙酬酸激酶基因pykA的上游同源臂、抗性基因和丙酬酸激酶基因pykA 的下游同源臂的DM分子導(dǎo)入邸216 (PKD46)，得到pykA替換為兩端帶有FRT的卡那霉素抗 性基因片段的中間菌；
[0017] 所述邸216 (P邸46)為將質(zhì)粒導(dǎo)入邸216中得到的菌；
[0018] 2)將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入所述中間菌，使所述PCP20質(zhì)粒上的FRT替換了中間菌中的 卡那霉素，得到去除卡那霉素的中間菌；
[0019] 3)將所述去除卡那霉素的中間菌先在37°C培養(yǎng)去除了溫敏質(zhì)粒PCP20和地046， 得到去除溫敏質(zhì)粒的中間菌；
[0020] 4)將所述去除溫敏質(zhì)粒的中間菌分別在卡那霉素抗性培養(yǎng)基、氯霉素抗性培養(yǎng) 基、無卡那霉素且無氯霉素平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取只在所述無卡那霉素且無氯霉素平板 培養(yǎng)基上生長，且在所述卡那霉素抗性培養(yǎng)基和所述氯霉素抗性培養(yǎng)基均不生長的菌，為 重組菌；
[0021] 所述兩端帶有FRT的卡那霉素抗性基因片段的核巧酸序列為序列5第41-1534 位；
[0022] 所述丙酬酸激酶基因pykA的上游同源臂為序列5第1-40位；
[0023] 所述丙酬酸激酶基因pykA的下游同源臂為序列5第1535-1574位。
[0024] 由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[00巧]上述方法或上述重組菌在生產(chǎn)下醇或提高下醇產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)下醇的方法。
[0027] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述重組菌，得到下醇。
[0028]本發(fā)明所提供的丙酬酸激酶缺陷型的菌株邸216CGMCCNo. 11590源自大腸桿菌， EB216菌株是在大腸桿菌BW25113的基礎(chǔ)上引入丙酬酸到下醇的生物合成途徑，并缺失一 些副產(chǎn)物代謝途徑獲得的，其基因型為A1化A::化d，Aa化E::ter，Δ化地C::a化E2,Δ(ac kA-pta)::c;rt,AycjhD::atoB,Aeu1:E::;lMh,A；lMhF::;lMhcb,Δ化yc-hyp)::FRT,Am化：：F RT，其下醇生產(chǎn)途徑見圖1。在邸216菌株的基礎(chǔ)上，敲除丙酬酸激酶基因，構(gòu)建丙酬酸激酶 缺陷型的突變體，該突變體的下醇產(chǎn)量得到提高。
[0029] 所述敲除丙酬酸激酶基因的方法，是借助地04,PKD46,PCP20等3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)施 的（示意圖見圖2)。
[0030] 所述地D4是PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因及其FRT的模板；
[0031] 所述地D46是用來表達(dá)λ-red同源重組酶的質(zhì)粒，該酶對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)需用阿拉 伯糖誘導(dǎo)；
[0032] 所述PCP20是用來表達(dá)Flp重組酶W消除篩選標(biāo)簽卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒。
[0033] 生理指標(biāo)均使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行測(cè)試。
[0034] 上述突變體菌株在小管中按照如下條件進(jìn)行發(fā)酵：微好氧靜置發(fā)酵；發(fā)酵溫度為 37°C;發(fā)酵時(shí)間為72h。
[0035] 上述突變體菌株在發(fā)酵罐中按照如下條件進(jìn)行發(fā)酵：轉(zhuǎn)速20化pm;發(fā)酵溫度為 37°C;發(fā)酵時(shí)間為72h。
[0036] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過的將生產(chǎn)下醇的出發(fā)菌邸216CGMCCNo.11590基因 組上的丙酬酸激酶pykA基因替換為FRT，得到重組菌，該重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的丙酬酸產(chǎn)量明 顯下降，下醇產(chǎn)量明顯上升，工程菌細(xì)胞的一系列生理指標(biāo)均發(fā)生了不同程度的變化。
【附圖說明】
[0037] 圖1為邸216體內(nèi)的下醇生產(chǎn)途徑。
[0038] 圖2為基因敲除的過程示意圖。
[0039] 圖3為表示pykA和pykF基因敲除成功的PCR驗(yàn)證結(jié)果。
[0040] 圖4為野生型與突變體菌株在小管中發(fā)酵的丙酬酸產(chǎn)量和下醇產(chǎn)量。
[0041] 圖5為野生型與工程菌在發(fā)酵罐中發(fā)酵的丙酬酸生產(chǎn)曲線和下醇生產(chǎn)曲線。
[0042] 圖6為使用高效液相色譜OPLC)分析發(fā)酵液的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 大腸桿菌邸216菌已于2015年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生 物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.11590,分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia colio
[0046] 圖1為邸216體內(nèi)的下醇生產(chǎn)途徑。
[0047] 實(shí)施例1、敲除大腸桿菌邸216中丙酬酸激酶基因制備重組菌
[0048] 下面的實(shí)施例用的是λ-red同源重組系統(tǒng)進(jìn)行敲除丙酬酸激酶基因（圖2)，其中 設(shè)計(jì)的質(zhì)粒：
[0049]P邸4記載在如下文獻(xiàn)中：Datsenko,KirillA.，andBairyLWanner.One-step