針對跨膜4超家族成員5蛋白的抗體或包含其的抗癌組合物的制作方法
【專利說明】針對跨膜4超家族成員5蛋白的抗體或包含其的抗癌組合 物
[0001]【相關申請的交叉引用】
[0002] 本申請是2014年2月26日提交的國際申請的國家階段，該國際申請要求2013年 2月26日提交的韓國專利申請No. 2013-0020547的優(yōu)先權，其全部內容通過引用并入本文。 【技術領域】
[0003] 本發(fā)明涉及與跨膜4超家族成員5蛋白（TM4SF5，transmembrane4superfamily member 5protein)相結合的抗體或其的抗原結合片段及對其進行編碼的核酸分子、重組載 體、轉化體和由此制備抗體的方法及上述抗體的用途。 【【背景技術】】
[0004] 在人類癌癥中，在胰腺癌、軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma)、胃癌、十二指腸乳 頭部上皮癌（carcinoma of the papilla vateri)及結腸癌中觀察到跨膜4超家族成員5 蛋白（TM4SF5, transmembrane 4superfamily member 5protein)的信使核糖核酸（mRNA) 的表達（Muller-Pillasch F，et al. Gene 208,25-30(1998))?？缒?4 超家族成員 5 蛋白 通過誘導的形態(tài)學伸長及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition)在肝 細胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma)的形成中起到重要的作用，在體外引起異常細 胞生長，在體內引起腫瘤的形成（Lee SA，et al. J Clin Invest 118,1354-1366(2008); Lekishvili T，et ah J Cell Sci 121,685-694(2008))。據(jù)報告，在基于跨膜 4 超家族成 員5蛋白和整聯(lián)蛋白α 2之間的細胞外相互作用的膠原蛋白類型I環(huán)境中抑制整聯(lián)蛋白 α 2功能的情況下，發(fā)生表達-誘導跨膜4超家族成員5蛋白的、未調節(jié)的細胞增殖及新生 血管形成（Lee SA，et al. Carcinogenesis 30,1872-1879(2009))。作為靶向跨膜 4 超家 族成員5蛋白的合成抑制劑的4'-(對甲苯磺酰-氨基）-4-羥基查耳酮（TSAHC，4'-(p-to luenesulfonyl-amido) -4-hydroxychalcone)在體外及體內抑制肝細胞癌生長及轉移（Lee SA，et al.ifepatology 49,1316-1325(2009))。這種事實表明在肝細胞癌形成中，跨膜4超 家族成員5蛋白的作用為用于開發(fā)肝細胞癌治療藥物的新型分子靶標。
[0005] 肝細胞癌為全世界最普遍存在的癌癥之一，尤其在亞洲和撒哈拉沙漠以南的非洲 (sub-Saharan Africa)廣泛發(fā)病。眾所周知，大部分肝細胞癌的發(fā)展為包含不典型增生結 節(jié)（dysplastic nodule)、初期肝細胞癌、高分化度肝細胞癌、中間及低分化度肝細胞癌的 多步驟過程（Forner A，et al. Lancet 379,1245-1255 (2012)) 〇
[0006] 結腸癌為全世界第三個普遍存在的癌癥，與發(fā)展中國家相比，在發(fā)達國家更普遍 存在。在結腸癌中最普遍的突變基因為與Wnt-APC-β-連環(huán)蛋白信號通路相關的別藻 藍蛋白（APC，allophycocyanin)、β-連環(huán)蛋白、AXINl、AXIN2、TCF7L2SNKDl(Korinek V，et al. Science 275,1784-1787(1997) ;Khan NP，et al. Mol Cell Biochem 355， 149-155(2011) ；Folsom AR,et al. Diabetes Care 31,905-909(2008) ；Guo J,et al. PLoS One 4, e7982(2009))。
[0007] 在本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文 及專利文獻的公開內容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發(fā)明所屬技術 領域的水平及本發(fā)明的內容。
[0008] 【發(fā)明概述】
[0009] 本發(fā)明人為了開發(fā)可診斷、預防及治療癌癥的抗體而研究努力。其結果，制備對作 為腫瘤特異抗原的跨膜4超家族成員5蛋白以高的親和力相結合的新型抗體及其的抗原結 合片段，并確認對癌細胞的生長、轉移及浸潤的上述抗體的優(yōu)秀抑制活性，從而完成了本發(fā) 明。
[0010] 因此，本發(fā)明的目的在于，提供與跨膜4超家族成員5蛋白相結合的抗體或其的 抗原結合片段。
[0011] 本發(fā)明的再一目的在于，提供與包含由雜交瘤細胞生產的抗體的互補性決定區(qū) (Q)R，complementarity determining region)的跨膜4超家族成員5蛋白相結合的抗體 或其的抗原結合片段。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于，提供用于生產上述抗體的雜交瘤細胞株。
[0013] 本發(fā)明的還一目的在于，提供對上述抗體或其的抗原結合片段的重鏈可變域進行 編碼的核酸分子。
[0014] 本發(fā)明的又一目的在于，提供對上述抗體或其的抗原結合片段的輕鏈可變域進行 編碼的核酸分子。
[0015] 本發(fā)明的又一目的在于，提供包含上述核酸分子的重組載體。
[0016] 本發(fā)明的又一目的在于，提供包含上述重組載體的宿主細胞。
[0017] 本發(fā)明的又一目的在于，提供上述抗體或其的抗原結合片段的制備方法。
[0018] 本發(fā)明的又一目的在于，提供確認或檢測試樣內是否存在跨膜4超家族成員5蛋 白的方法。
[0019] 本發(fā)明的又一目的在于，提供癌癥的預防或治療用藥劑學組合物。
[0020] 本發(fā)明的又一目的在于，提供跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質檢測用試劑盒。
[0021] 本發(fā)明的又一目的在于，提供癌癥的預防或治療方法。
[0022] 以下發(fā)明的詳細說明、發(fā)明要求保護范圍及附圖更加明確本發(fā)明的其他目的及優(yōu) 點。 【【附圖說明】】
[0023] 圖la、圖lb、圖lc、圖Id及圖Ie示出生產抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆 抗體的雜交瘤細胞的篩選。圖Ia中，將h跨膜4超家族成員5蛋白肽給藥到四只BALB/c 小鼠的腹腔內來進行免疫化。采集血清，并用酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒分析了整個免疫 球蛋白G。圖Ib為使用已進行h跨膜4超家族成員5蛋白肽免疫化的小鼠的脾細胞的細 胞-融合實驗的初期篩選的酶聯(lián)免疫吸附測定法結果。圖Ic中，為了生產單克隆抗體，篩 選了圖Ib的6個雜交瘤（箭頭）。圖Id中，為了生成多個圖Ic的6個雜交瘤（箭頭），向 BALB/c小鼠的腹腔內給藥。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法對上述多個進行篩選，來檢測了 h跨 膜4超家族成員5蛋白肽相關的特定抗體的雜交瘤。圖Ie中，為了生成多個，將2D4-18雜 交瘤克隆給藥到7只BALB/c小鼠的腹腔內。聚集血清（圖la)、雜交瘤培養(yǎng)上清液（圖Ib 及圖1C)及多個（圖Id及圖le)之后，用酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒分析了肽特異性整個 免疫球蛋白G的效價和量。
[0024] 圖2示出從給藥小鼠雜交瘤細胞株2D4-18的小鼠的腹水中純化抗-跨膜4超 家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的結果。利用十二烷基硫酸鈉（SDS，sodium dodecyl sulfate)-聚丙稀酰胺凝膠電泳（PAGE，polyacrylamide gelelectrophoresis)分離標記、 腹水及純化的單克隆抗體，并用考馬斯亮藍進行了染色。
[0025] 圖3示出抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的結合親和度。圖3 的（A)部分為對h跨膜4超家族成員5蛋白的結合親和度，圖3的（B)部分為對m跨膜4 超家族成員5蛋白的結合親和度。
[0026] 圖4示出在肝細胞癌組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達。圖4的（A)部分為 正常肝組織，圖4的（B)部分為表達>75%、74-50%、49-11 %的跨膜4超家族成員5蛋白 的肝細胞癌組織的例，比例尺=左側200 μ m，右側50 μ m。
[0027] 圖5a及圖5b示出在結腸癌組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達。圖5a的（A) 部分為正常結腸組織，圖5a的（B)部分為表達> 75 %、74-50 %、49-11 %及< 10 %的跨膜 4超家族成員5蛋白的結腸癌組織的例，圖5b的（C)部分為具有已轉移的肝癌的三個結腸 癌患者的結腸癌組織及肝轉移組織，比例尺=左側200 μ m，右側50 μ m。
[0028] 圖6a、圖6b及圖6c示出肝細胞癌細胞及結腸癌細胞生長的抗-跨膜4超家族成 員5蛋白單克隆抗體2D4-18的抑制效果。圖6a示出肝細胞癌細胞株及結腸癌細胞株中跨 膜4超家族成員5蛋白信使核糖核酸的表達。圖6b示出肝細胞癌細胞株的生長的抗-跨 膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的效果。各個以三次實驗的平均值（mean) 土標 準偏差（SD)表示。**P < 0. 01 (vs正常免疫球蛋白G對照組）。圖6c示出結腸癌細胞的 生長的抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的效果。各個以三次實驗的平均 值土標準偏差表示。**P < 0. 01 (vs正常免疫球蛋白G對照組）。
[0029] 圖7示出肝細胞癌細胞的移動及浸潤的抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體 2D4-18的效果。圖7的（A)部分為移動分析，圖7的（B)部分為浸潤分析，圖7的（C)部分 為傷口治療分析，比例尺=200 μ m。
[0030] 圖8示出結腸癌細胞的移動及浸潤的抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體 2D4-18的效果。圖8的（A)部分為移動分析，圖8的（B)部分為浸潤分析，圖8的（C)部分 為傷口治療分析，比例尺=200 μ m。
[0031] 圖9a及圖9b示出在肝細胞癌腫瘤組織中抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗 體2D4-18的生物體內分布。圖9a中，剖切小鼠，并使用實時IVIS圖像系統(tǒng)200來觀察了 小鼠生物體內抗體的位置（上面板），去除腫瘤組織并放置在小鼠的左側（下面板）。圖9b 為利用共聚焦顯微鏡來觀察腫瘤組織的結果，比例尺=20 μ m。
[0032] 圖10示出在異種移植小鼠模型中肝細胞癌腫瘤生長的已給藥的抗-跨膜4超家 族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的治療功效。圖10的（A)部分為肝細胞癌腫瘤組織的照 片，圖10的（B)部分為腫瘤體積，圖10的（C)部分為腫瘤重量，圖10的（D)部分為體重， 圖10的（E)部分表示在腫瘤組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達，用褐色表示跨膜4超 家族成員5蛋白的陽性部位，并呈現(xiàn)比例尺=20 μ m。
[0033] 圖11示出在同種移植小鼠模型中肝細胞癌腫瘤生長的已給藥的抗-跨膜4超家 族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的治療功效。圖11的（A)部分為肝細胞癌腫瘤組織的照 片，圖11的（B)部分為腫瘤體積，圖11的（C)部分為腫瘤重量，圖11的（D)部分為體重， 圖11的（E)部分表示在腫瘤組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達，用褐色表示跨膜4超 家族成員5蛋白的陽性部位，并呈現(xiàn)比例尺=20 μ m。
[0034] 圖12示出在異種移植小鼠模型中結腸癌生長的抗-跨膜4超家族成員5蛋白單 克隆抗體2D4-18的治療功效。圖12的（A)部分為結腸癌組織的照片，圖12的（B)部分為 腫瘤體積，圖12的（C)部分為腫瘤重量，圖12的（D)部分為體重，圖12的（E)部分表示在 腫瘤組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達，用褐色表示跨膜4超家族成員5蛋白的陽性 部位，并呈現(xiàn)比例尺=20 μ m。
[0035] 圖13示出在同種移植小鼠模型中結腸癌生長的抗-跨膜4超家族成員5蛋白單 克隆抗體2D4-18的治療功效。圖13的（A)部分為結腸癌組織的照片，圖13的（B)部分為 腫瘤體積，圖13的（C)部分為腫瘤重量，圖13的（D)部分為體重，圖13的（E)部分表示在 腫瘤組織中跨膜4超家族成員5蛋白的表達，用褐色表示跨膜4超家族成員5蛋白的陽性 部位，并呈現(xiàn)比例尺=20 μ m。
[0036] 圖14示出在異種移植結腸癌模型中抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體 2D4-18的肺轉移抑制效果。圖14的（A)部分及圖14的（B)部分為肺的照片，圖14的（C) 部分為腫瘤重量，圖14的（D)部分為體重。
[0037] 圖15示出從雜交瘤細胞克隆2D4-18分離的重鏈及輕鏈可變域的互補脫氧核糖核 酸序列（2D4-18)。圖15的（A)部分為重鏈可變域的序列，圖15的（B)部分表示輕鏈可變 域的序列，并在互補脫氧核糖核酸序列下面記載了預測到的氨基酸序列。
[0038] 圖16示出從雜交瘤細胞克隆2D4-18分離的重鏈及輕鏈可變域的互補脫氧核糖核 酸序列（2D4-18(1))。圖16的（A)部分為重鏈可變域的序列，圖16的（B)部分表示輕鏈可 變域的序列，并在互補脫氧核糖核酸序列下面記載了預測到的氨基酸序列。
[0039] 圖17示出表達載體pFabE-2D4-18及pFabE-2D4-18 (1)的圖譜（A)及從表達載體 所表達的、預測到的蛋白質結構（B)。
[0040] 圖18示出在大腸桿菌中重組Fab-2D4-18的小規(guī)模生產。圖18的（A)部分為還 原的整個細胞溶解物，圖18的（B)部分為非-還原的整個細胞溶解物。
[0041] 圖19示出在大腸桿菌中重組Fab-2D4-18的生產及純化。圖19的（A)部分為還 原的蛋白質樣品，圖19的（B)部分為非-還原的蛋白質樣品。
[0042] 圖20示出在大腸桿菌中重組Fab-2D4_18 (1)的生產及純化。圖20的（A)部分為 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，圖20的（B)部分為免疫印跡法結果。
[0043] 圖21示出重組Fab-2D4-18的結合親和度。
[0044] 圖22示出肝細胞癌細胞生長的重組Fab-2D4-18的抑制效果。
[0045] 圖23示出肝細胞癌細胞的重組Fab-2D4_18 (1)的抑制效果。
[0046] 【發(fā)明詳述】
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供抗體或其的抗原結合片段，上述抗體或其 的抗原結合片段與跨膜4超家族成員5蛋白相結合，上述抗體或其的抗原結合片段包括：重 鏈可變域，包含序列表中序列19的互補性決定區(qū)H1、序列表中序列20的互補性決定區(qū)H2 及序列表中序列21的互補性決定區(qū)H3 ;以及輕鏈可變域，包含序列表中序列22的互補性 決定區(qū)LU序列表中序列23的互補性決定區(qū)L2及序列表中序列24的互補性決定區(qū)L3。
[0048] 本發(fā)明人為了開發(fā)可診斷、預防及治療癌癥的抗體而研究努力。其結果，制備對作 為腫瘤特異抗原的跨膜4超家族成員5蛋白以高的親和力相結合的新型抗體及其的抗原結 合片段，并確認了對癌細胞的生長、轉移及浸潤的上述抗體的優(yōu)秀抑制活性。
[0049] 以下，在下述中進行詳細的說明。
[0050] 【1.抗-跨膜4超家族成