s馬來酸、達卡巴嗪、放線菌素、鹽酸多柔比星、脫氧鳥苷、右雷佐生、去水衛(wèi)矛醇、地 吖醌、二溴衛(wèi)矛醇、膜海鞘素 B、二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyl dithiocarbamate)、肌 苷二醛、二氫-5-阿扎胞苷、多柔比星、棘霉素、依達曲沙、依地福新、依氟鳥氨酸、鈉鉀鎂鈣 葡萄糖注射液、依沙蘆星、表柔比星、伊索比星、雌莫司汀磷酸、雌性激素、依他硝唑、阿米 福汀、依托泊苷、法曲唑、法扎拉濱、芬維A胺、非格司亭、非那司提、黃酮醋酸、氟尿苷、磷酸 氟達拉濱、5" -氟尿嘧啶、Fluosol?、氟他胺、硝酸鎵、吉西他濱、醋酸戈舍瑞林、西磺非、六 亞甲基雙乙酰胺（hexamethylene bisacetamide)、高三尖杉酯堿、硫酸肼、4-輕雄留稀二 酮、羥基脲、鹽酸伊達比星、異環(huán)磷酰胺、4-甘薯黑疤霉二醇、異丙鉑、異維甲酸、甲酰四氫葉 酸鈣鹽、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、柔紅霉素脂質(zhì)體、捕獲脂質(zhì)體的阿霉素、環(huán)己亞硝脲、氯 尼達明、美登素、氮芥鹽酸鹽、美法侖、美諾立爾、美巴龍、6-巰基嘌呤、美司鈉、卡介苗甲醇 提取物、甲氨蝶呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、米托胍腙、絲裂霉素-C、米托坦、鹽酸米托蒽 醌、單核細胞/巨噬細胞集落刺激因子、大麻隆、萘福昔定、新制癌菌素、醋酸奧曲肽、奧馬 鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、pala、噴司他丁、哌嗪二酮、哌泊溴烷、吡柔比星、吡曲克辛、鹽酸吡咯 蒽醌、PIXY-321、光神霉素、Π 卜吩姆鈉、潑尼氮芥、丙卡巴肼、孕激素、吡唑呋喃菌素、雷佐生、 沙莫司亭、司莫司汀、螺鍺、螺莫司汀、鏈黑菌素、鏈佐星、磺氯苯脲、蘇拉明鈉、他莫昔芬、替 加氟、替尼泊苷、二酰胺、替羅昔隆、硫鳥嘌呤、賽替派、胸苷注射液、噻唑呋林、托泊替康、托 瑞米芬、維甲酸、鹽酸三氟拉嗪、三氟胸苷、三甲曲沙、腫瘤壞死因子（TNF，tumor necrosis factor)、烏拉莫司丁、硫酸長春堿、硫酸長春新堿、長春酰胺、長春瑞賓、長春利定、Yoshi 864、佐柔比星、胞啼啶阿拉伯糖苷、依托泊苷、米爾法蘭、泰索帝、紫杉酚及它們的混合物， 但并不局限于這些。
[0118] 【VI.跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質(zhì)檢測方法及癌癥的診斷】
[0119] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的抗體或其的抗原結(jié)合片段 來確認（檢測）試樣內(nèi)是否存在跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質(zhì)的方法。
[0120] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗體或其的抗原結(jié)合片段 的跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質(zhì)檢測用試劑盒。
[0121] 本發(fā)明的抗體可適應于生物學試樣來檢測跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質(zhì)。在本 說明書中使用的術語"生物學試樣"可例舉組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、尿、淋巴液、 脊髓液、組織剖檢試樣（腦、皮膚、淋巴結(jié)、脊髓等）、細胞培養(yǎng)上清液、破裂的真核細胞及細 菌表達系統(tǒng)等，但并不局限于這些。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，作為上述生物學試樣，細胞為癌細胞。
[0123] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，上述試劑盒為癌癥診斷用試劑盒。本發(fā)明的試劑盒能夠以 操作生物學試樣或以未操作的狀態(tài)與本發(fā)明的抗體發(fā)生反應，從而可作為用于確認是否發(fā) 生癌癥的用途來使用。
[0124] 在生物學試樣中，跨膜4超家族成員5蛋白蛋白質(zhì)的檢測可利用比色法 (colormetric method)、電化學法（electrochemical method)、焚光法（fluorimetric method)、發(fā)光法（Iuminometry)、粒子計數(shù)法（particle counting method)、肉眼測定法 (visual assessment)或閃爍計數(shù)法（scintillation counting method)來檢測抗原-抗 體復合體的形成而執(zhí)行。本說明書中的"檢測"用于檢測抗原-抗體復合體，可使用多種標 記物來實施。作為標記物的具體例，包含酶、熒光物、配體、發(fā)光物、微小粒子或放射性同位 素。
[0125] 作為檢測標記物使用的酶包含乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase)、堿性 磷酸酶（alkaline phosphatase)、β-D-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase)及β -內(nèi)酰胺酶（β-lactamase)等，作為焚光物包含焚光素、Eu3+、Eu3+螯 合物或穴合物等，作為配體包含生物素衍生物等，作為發(fā)光物包含吖啶酯（acridinium ester)及異氨基苯二酰肼（isoluminol)衍生物等，作為微小粒子包含膠體金及著色的乳 膠等，作為放射性同位素包含57Co、3H、125I及125I-邦東（Bonton)亨特（Hunter)試劑等。
[0126] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，可利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA， enzymelinkedimmunosorbentassay)來檢測抗原-抗體復合體。酶聯(lián)免疫吸附測定法包括 直接酶聯(lián)免疫吸附測定法、間接酶聯(lián)免疫吸附測定法、直接夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法及間 接夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法等多種酶聯(lián)免疫吸附測定法，上述直接酶聯(lián)免疫吸附測定法利 用用于識別附著于固體載體的抗原的已標記的抗體，上述間接酶聯(lián)免疫吸附測定法利用 在附著于固體載體的抗原的抗體的復合體中識別捕獲抗體的已標記的第二抗體，上述直接 夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法利用在附著于固體載體的抗體和抗原的復合體中識別抗原的已 標記的另一抗體，上述間接夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法利用使附著于固體載體的抗體和在抗 原的復合體中識別抗原的另一抗體發(fā)生反應之后，識別上述抗體的已標記的第二抗體。本 發(fā)明的抗體可具有檢測標記，在不具有檢測標記的情況下，可捕獲本發(fā)明的抗體，并處理具 有檢測標記的另一抗體來確認。
[0127] 歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下：
[0128] (i)本發(fā)明提供與跨膜4超家族成員5蛋白相結(jié)合的抗體或其的抗原結(jié)合片段及 其的用途。
[0129] (ii)本發(fā)明的抗體以高的親和力與腫瘤特異抗原跨膜4超家族成員5蛋白相結(jié) 合，并顯著抑制表達跨膜4超家族成員5蛋白的癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移及浸潤，因而可利用于 表達跨膜4超家族成員5蛋白的多種癌癥的診斷、預防或治療。
[0130] 以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明。這些實施例只用于更詳細地說明本發(fā)明， 根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍并不限制于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術領域的 普通技術人員來說是顯而易見的。 【實施例】
[0131] 【實驗材料及實驗方法】
[0132] 【小鼠抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的生產(chǎn)】
[0133] 以隔?ο日將h跨膜4超家族成員5蛋白肽（13Snrtlwdrceapprv151)四次給藥到雌 性BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)。從已免疫化的脾臟取得脾細胞（Splenocytes)之后，根據(jù)標準雜 交瘤技術（Yokoyama WM, et al. Curr Protoc Tmmunol Chapter 2，Unit 2. 5 (2006))，在存 在有 40% (w/v)的聚乙二醇（polyethylene glycol)的情況下，與 HAT-sensitive SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞相融合。為了確認與h跨膜4超家族成員5蛋白肽的結(jié)合，利用酶聯(lián)免疫 吸附測定法來對雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液進行測驗，并篩選了陽性雜交瘤細胞。亞克隆酶 聯(lián)免疫吸附測定法-陽性雜交瘤細胞組之后，為了產(chǎn)生腹水注射到BALB/c小鼠腹腔。使用 蛋白質(zhì)A柱層析（安發(fā)瑪西亞生物技術公司（Amersham Pharmacia Biotech))來從腹水液 中純化了抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體（2D4-18)。
[0134] 【酶聯(lián)免疫吸附測定法】
[0135] 在各個給藥之前及最終給藥10天之后，犧牲小鼠來得到了血清。為了確認整 個免疫球蛋白G效價及量，用5 μg/mlh跨膜4超家族成員5蛋白肽涂敷96-孔免疫板 (Nalgen Nunc International)，并用含有1 %的牛血清白蛋白（BSA)的0.05%的抗體稀釋 液（PBST)來封閉了兩個小時。去除封閉溶液之后添加100 μ 1的培養(yǎng)上清液，并在常溫條件 下培養(yǎng)兩個小時之后，利用抗體稀釋液來洗滌，之后與辣根過氧化物酶（HRP，horseradish peroxidase)-結(jié)合的抗-免疫球蛋白G抗體之類的檢測抗體一同培養(yǎng)兩個小時。用四甲 基聯(lián)苯胺（TMB，tetramethyl benzidine)底物溶液開發(fā)比色分析法，并在450nm下，使用 Spectra Max 250微板閱讀器來測定了吸光度。
[0136] 【表面等離子體共振（SPR，Surface plasmon resonance)的分析】
[0137] 在25°C溫度下，使用Biacore TlOO(Biacore)來測定了與人類及小鼠跨膜4超家 族成員5蛋白相結(jié)合的抗-h跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的親和度。在涂 敷有鏈霉親和素的CM4傳感器芯片的各個流經(jīng)的細胞表面上捕獲（capture) 了生物素化 肽。使用生物素作為陰性對照組。以30ml/分鐘的速度注入了 2~32nM濃度的抗-跨膜 4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18。使用Biacore Bia評價軟件（version 3.0)來評 價了數(shù)據(jù)。
[0138] 【組織微陣列及免疫組織化學】
[0139] 使用以下陣列，即：肝癌組織（A204及A204(II))、結(jié)腸癌組織（A203(VII))及結(jié) 腸癌組織-肝轉(zhuǎn)移（A203III)。肝癌組織陣列由與各個載玻片上的樣品相應的4個或8個 非 -腫瘤（non-neoplastic)及多種組織型（histotypes)的相同的肝細胞癌組織核心形 成。結(jié)腸癌組織陣列（A203 (VII))包含了與各個載玻片上的樣品相應的8個非-腫瘤及多 種組織型（histotypes)的相同的結(jié)腸癌組織核心形成的45個病例。具有相應的結(jié)腸正常 組織的結(jié)腸癌組織-肝轉(zhuǎn)移（18病例）由與各個載玻片上的樣品相應的18個非-腫瘤及 來源于各個癌癥病例的4個點形成。在二甲苯中將載玻片進行脫石蠟化，并且再水化之后 在甲醇中，將新鮮的〇. 3%的過氧化氫處理了 15分鐘。用抗-跨膜4超家族成員5蛋白單 克隆抗體將組織陣列進行了染色。
[0140] 【細胞培養(yǎng)】
[0141] 在韓國細胞系研究基金會取得了如Huh-7、Hep3B及SNU-761之類的人類肝細胞 癌細胞株及如HT-29及LoVo之類的人類結(jié)腸癌細胞株及小鼠結(jié)腸癌細胞株CT-26。從 ATCC(美國菌種保藏中心）取得了小鼠肝癌細胞株BNL-肝細胞癌。在含有10%的胎牛血 清（FBS ;Hyclone)、2mM的谷氨酰胺、100U/ml的青霉素及100 μ g/ml的鏈霉素的DMEM中管 理了 !fep3B、BNL-肝細胞癌及CT-26細胞。在含有10%的胎牛血清、25禮的4-羥乙基哌嗪 乙磺酸（HEPES)、lOOU/ml的青霉素及100 μ g/ml的鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中管理了其 他細胞株。在95%的空氣及5%的CO2條件下，以37°C溫度培養(yǎng)了所有細胞。
[0142] 【跨膜4超家族成員5蛋白信使核糖核酸表達的檢測】
[0143] 為了分析跨膜4超家族成員5蛋白的表達，實施了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應及流式 細胞（FACS)分析。使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen)來提取整個核糖核酸，并合成了互補 脫氧核糖核酸。使用以下引物對實施了 25個循環(huán)的標準聚合酶鏈式反應（PCR，Polymerase Chain Reaction):小鼠 GAPDH(序列表中序列1及序列表中序列2,501bp);小鼠跨膜4超 家族成員5蛋白（序列表中序列3及序列表中序列4,174bp);人類β -肌動蛋白（序列表 中序列5及序列表中序列6, 500bp);人類跨膜4超家族成員5蛋白（序列表中序列7及 序列表中序列8,408bp)。
[0144]【噻唑藍（MTT)的分析】
[0145] 通過利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5_二苯基四氮唑溴鹽（3-(4， 5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(噻 挫藍， Sigma-Aldrich (西格瑪奧德里奇））溶液的噻唑藍分析確認了將抗-跨膜4超家族成員5蛋 白單克隆抗體2D4-18 (10 μ g/ml)處理5天的癌細胞的生長。將噻唑藍溶液添加到各孔中， 并在37°C溫度下將板培養(yǎng)了 4個小時。在去除培養(yǎng)基之后，在二甲基亞砜（DMS0，Dimethyl sulfoxide)中溶解了甲臢結(jié)晶體。在595nm的分光光度計（參照波長650nm)中檢測了發(fā) 色現(xiàn)象。
[0146] 【細胞移動及浸潤分析】
[0147] 將具有8 μπι的孔隙的Transwell小室（Corning Costar)使用于分析中。為了移 動分析，用10 μ g/ml的明膠涂敷了 Trans-well小室膜的下部面。為了浸潤分析，用I. 2mg/ ml的基質(zhì)膠（BD Biosciences)及10 μ g/ml的明膠分別涂敷了小室膜的上部面和下部面。 在正常免疫球蛋白G或包含抗-跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18的無血清培 養(yǎng)基中懸浮細胞（Huh-7或CT-26) (5X IO4細胞/ml)，并分注于Trans-well的最上面。將 含有5%的胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基放在下面小室。培養(yǎng)12小時之后，用4%的多聚甲醛將 過濾器的下部表面上的浸潤細胞（invaded cells)固定30分鐘，并用0.005%的結(jié)晶紫染 色30分鐘之后，利用顯微鏡來進行計數(shù)。
[0148] 【傷口治療（Wound-healing)分析】
[0149] 為了傷口治療分析，將IX IO6細胞（Huh-7或CT-26)分注于6-孔板，并在包含 血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚之后，利用移液管的尖在單層誘發(fā)傷口。將正常免疫球蛋白G或 抗_h跨膜4超家族成員5蛋白單克隆抗體2D4-18 (10 μ g/ml)處理指定時間。用4%的多 聚甲醛將細胞固定30分鐘，并用吉母薩染色30分鐘。
[0150]【動物】
[0151] 在無特異病原體環(huán)境（specific-pathogen-free condition)下，維持并管理了 4 周齡的雄性 BALB/cAnNCri-nu/nu 小鼠及 BALB/c 小鼠 （Central Lab，Animal，Inc)。根據(jù) NVRQS(National Veterinary Research&Quarantine Service)的實驗室動物的飼養(yǎng)及利 用來實施了動物研究的所有程序。用舒泰50+隆朋麻醉小鼠之后使其犧牲。
[0152] 【肝細胞癌小鼠模型】
[0153] 向30只BALB/cAnNCri-nu/nu小鼠及30只BALB/c小鼠的背部右側(cè)面（dorsal right flank)分別皮下注射了包含50%的基質(zhì)膠（BD biosciences)的5X106Huh_7細胞 及包含50%的基質(zhì)膠的5 X IO6BNL-肝細胞癌細胞。當腫瘤直徑達到5_時，將小鼠任意分 類為磷酸鹽緩沖液、免疫球蛋白G對照組及抗-跨膜4超家族成員5蛋白