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      用于治療胃腸道間質(zhì)瘤(gist)的方法和組合物的制作方法_2

      文檔序號:9620338閱讀:來源:國知局
      Smith 和 Waterman,Advances in Applied Mathematics,482_489(1981)),蛋白序列和結(jié)構(gòu)的 Schwarz and Dayhof (1979)Atlas, Dayhof,M. 0·,Ed pp 353-358 ;BLAST 程序(基本局部比對搜索工具;(Altschul,S. F., W.Gish,等人(1990)J Mol Biol,215 :403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN,AL1GN-2, CLUSTAL,或 Megalign (DNASTAR)軟件。另外,本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定測量比對的適當(dāng)參數(shù),其包括在被比較的序列全長上實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任意 算法。通常,對于蛋白或核酸,比較的長度可以是任意長度,多至并包括全長(例如,5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)。保守替換通常包括 以下基團(tuán)內(nèi)的替換:甘氨酸、丙氨酸;纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰 胺、谷氨酰胺;絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸;及苯丙氨酸、酪氨酸。
      [0034] "受試者"是指哺乳動物(例如,人或非人)。
      [0035] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢會由以下詳細(xì)的說明書、附圖及權(quán)利要求書而顯而易 見。
      [0036] 附圖簡述
      [0037] 圖1A-1B為抗-KIT嵌合免疫受體的結(jié)構(gòu)的描述。圖IA顯示了第一代和第二代 CIR遺傳構(gòu)建體的示意圖。圖IB顯示了第一代和第二代CIR的結(jié)構(gòu)。抗-KIT CIRs是自 抗-CEA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體重新工程化的,其中KIT配體(KL)的胞外結(jié)構(gòu)域被擴(kuò)增并 克隆以取代抗-CEA胞外結(jié)構(gòu)域。
      [0038] 圖2A-2B為顯示人抗-KIT設(shè)計(jì)者T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表型的圖。圖2A顯示了 分離的PBMC和用表達(dá)KIT特異性CIRs的逆轉(zhuǎn)錄病毒激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代人T細(xì)胞的圖。 陰影柱狀圖代表設(shè)計(jì)者T細(xì)胞,和開放曲線代表未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。圖2B顯示了第一代 和第二代轉(zhuǎn)導(dǎo)的設(shè)計(jì)者T細(xì)胞的表型的流式細(xì)胞術(shù)分析,所述分析證明中央型記憶表型 (⑶45R0+⑶62LCCR7+)的T細(xì)胞占大多數(shù)。數(shù)據(jù)為三次或更多次重復(fù)的代表。
      [0039] 圖3A-3G為顯示人抗-KIT設(shè)計(jì)者T細(xì)胞在體外保持增殖能力的圖。將第一代和 第二代設(shè)計(jì)者T細(xì)胞與人KIT+GIST細(xì)胞系、圖3A-3B和3E中的GIST882,以及圖3C-3D和 3F中的GIST48共培養(yǎng)。用CFSE對設(shè)計(jì)者T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTRL T細(xì)胞染色,并且通過對 CD3+細(xì)胞設(shè)門測量CFSE稀釋而評估增殖。為確認(rèn)被KIT+GIST細(xì)胞系激活的設(shè)計(jì)者T細(xì) 胞,用ELISA來測量IFN γ產(chǎn)量,并發(fā)現(xiàn)所述IFN γ產(chǎn)量在462-475pg/mL范圍內(nèi),而未修飾 的T細(xì)胞(CTRL)的IFNy產(chǎn)量可忽略(G)。數(shù)據(jù)為三次或更多次重復(fù)的代表。
      [0040] 圖4A-4E為顯示人抗-KIT設(shè)計(jì)者T細(xì)胞有效裂解KIT+腫瘤細(xì)胞的能力的圖。圖 4A顯示了來自評價(jià)腫瘤細(xì)胞裂解之后的酶釋放的LDH測定的結(jié)果,所述腫瘤細(xì)胞裂解在來 自第一代和第二代設(shè)計(jì)者T細(xì)胞與輻射GIST882細(xì)胞的共培養(yǎng)的上清液上進(jìn)行。最大釋放 由最高實(shí)驗(yàn)值來定義。圖4B-4C顯示了用以確認(rèn)設(shè)計(jì)者T細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力的,與未標(biāo) 記T細(xì)胞一起培養(yǎng)的并用CFSE標(biāo)記的經(jīng)輻射的GIST-88s或GIST48細(xì)胞的圖。通過對剩 余的活細(xì)胞設(shè)門來測量CFSE熒光的降低,從而定量腫瘤細(xì)胞死亡。圖4D-4E顯示了通過關(guān) 于未修飾T細(xì)胞(CTRL)的MFI數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化MFI數(shù)據(jù)而定量的第一代和第二代設(shè)計(jì)者T細(xì) 胞的殺傷百分比的結(jié)果。數(shù)據(jù)為至少三次重復(fù)的代表。
      [0041] 圖5A-5E為在體內(nèi)測試人抗-KIT設(shè)計(jì)者T細(xì)胞的結(jié)果。圖5A顯示了來自皮下異 種移植模型的單個代表性實(shí)驗(yàn)的中值結(jié)果,其中在用人抗-KIT設(shè)計(jì)者T細(xì)胞處理之前,將 GIST882細(xì)胞皮下注射入免疫缺陷小鼠,和圖5B顯示了來自3次實(shí)驗(yàn)的合并數(shù)據(jù)的結(jié)果。 圖5C顯示了由水平條表示的灌注后第5天、第10天、第15天的中值腫瘤尺寸的線圖,單個 腫瘤測量由單個數(shù)據(jù)點(diǎn)表示。圖f5D顯示檢測腫瘤浸潤C(jī)D3+T細(xì)胞(箭頭)的免疫組織化學(xué) 印跡(上排IOx并且下排40x)。圖5E顯示用于評估小鼠中腫瘤壞死(星號)的程度的常 規(guī)組織學(xué)印跡,所述小鼠用第一代和第二代設(shè)計(jì)者T細(xì)胞處理,兩者有或沒有增補(bǔ)IL2 (左 列IOx并且右列40x)。
      [0042] 發(fā)明詳述
      [0043] 大體上,本發(fā)明特征在于編碼嵌合免疫受體(CIR)蛋白的核酸構(gòu)建體,所述嵌合 免疫受體(CIR)蛋白包括KIT-配體(KL)或干細(xì)胞因子(SCF)。當(dāng)表達(dá)于細(xì)胞(例如,受試 者T細(xì)胞)中時(shí),這些核酸構(gòu)建體可用于治療與增長的KIT表達(dá)或異常的KIT活性相關(guān)的 疾病。此類疾病的實(shí)例包括胃腸道間質(zhì)瘤(GIST),特別是抗伊馬替尼和其它常規(guī)療法的那 些。某些實(shí)施方案包括工程CIR,所述工程CIR包括KIT的自然配體(例如,KIT-配體(KL)) 或干細(xì)胞因子(SCF)。例如,KIT-配體(KL)或干細(xì)胞因子(SCF)可與T細(xì)胞(第一代,第 一代)受體的⑶3 ζ鏈組分或⑶3 ζ +⑶28協(xié)同刺激分子(第二代,第二代)融合。第二代 T細(xì)胞表達(dá)靶向KIT+腫瘤并同時(shí)整合CD28協(xié)同刺激信號的構(gòu)建體。在下面列舉的實(shí)施例 中,此第一代和第二代T細(xì)胞在體外生產(chǎn)并在體內(nèi)測試,以證明其破壞KIT+腫瘤的效力。
      [0044] 胞外結(jié)構(gòu)域
      [0045] 本發(fā)明的CIR特征在于能夠特異結(jié)合酪氨酸蛋白激酶KIT(KIT)并能夠?qū)⒈景l(fā)明 的CIR指引至表達(dá)KIT+的腫瘤細(xì)胞的胞外結(jié)構(gòu)域。因此,本發(fā)明的CIR的胞外結(jié)構(gòu)域可包 括,例如全長干細(xì)胞因子(SCF)或KIT-配體(KL),或其片段?;蛘撸霭饨Y(jié)構(gòu)域可包括 特異性抑制KIT二聚化、抑制酪氨酸激酶活性、和/或KIT磷酸化的任意結(jié)合部分、抗KIT 的抗體片段(例如,抗cKIT抗體,例如可從Abeam,Biolegend,Genway Biotech等商售可得 的那些)。
      [0046] 所述胞外結(jié)構(gòu)域可任選地包括可用于純化表達(dá)的CIR的另外蛋白標(biāo)簽,例如人源 c-myc標(biāo)簽(EQKLISEEDL),在N-末端的,Z結(jié)構(gòu)域、HA標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽,和/或GST標(biāo)簽。 優(yōu)選地選擇蛋白標(biāo)簽以使所述標(biāo)簽不妨礙KL與KIT相互作用。所述胞外結(jié)構(gòu)域也可任選 地包括可用于成像的另外的蛋白標(biāo)簽,例如熒光蛋白。包含這些蛋白可促進(jìn)構(gòu)建體的未來 的研究并創(chuàng)建更有效的構(gòu)建體。
      [0047] 跨膜結(jié)構(gòu)域
      [0048] 本發(fā)明的CIR特征在于跨膜結(jié)構(gòu)域,例如源自⑶28或⑶3 ζ的那些。包含ζ鏈的 跨膜區(qū)域或CD28的跨膜或部分胞外結(jié)構(gòu)域提供了分子間二硫鍵的能力。預(yù)測包含這些跨 膜結(jié)構(gòu)域的CIRs通過位于ζ的跨膜的半胱氨酸殘基或通過位于CD28的部分胞外結(jié)構(gòu)域 的近端半胱氨酸殘基(⑶28的第123位)形成二硫化物連接的二聚體,模擬天然ζ及⑶28 的二聚體構(gòu)型。
      [0049] 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域
      [0050] 本發(fā)明的CIR還特征在于當(dāng)結(jié)合于KIT+腫瘤細(xì)胞時(shí)調(diào)節(jié)宿主T細(xì)胞活化以激活 T細(xì)胞基細(xì)胞毒反應(yīng)攻擊KIT+腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施例中,用于本發(fā)明的本 發(fā)明CIRs的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括CD3 ζ、CD28,或其片段。本發(fā)明特征還在于源自多個胞外結(jié) 構(gòu)域的多肽的融合,所述胞外結(jié)構(gòu)域當(dāng)結(jié)合于KIT+腫瘤細(xì)胞時(shí)用于增強(qiáng)T細(xì)胞的活化(例 如,包括⑶3 ζ和⑶28二者的活性片段的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或僅包括⑶3 ζ的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。
      [0051] 核酸構(gòu)建體
      [0052] 本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用于在宿主細(xì)胞(例如分離自受試者的T細(xì)胞)中表達(dá) CIR構(gòu)建體。CIR構(gòu)建體可包含于單個核酸構(gòu)建體或多個核酸構(gòu)建體中。編碼CIR的核酸 序列可變?yōu)榕c用于產(chǎn)生CIR的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞更兼容的密碼子。密碼子可被取代以消 除限制位點(diǎn)或包括沉默限制位點(diǎn),這可有助于表達(dá)載體中核酸的克隆并加工所選宿主細(xì)胞 中的核酸。為了促進(jìn)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,核酸構(gòu)建體可包含于病毒載體中(例如,逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體或腺病毒載體)或被設(shè)計(jì)為通過電穿孔或化學(xué)方法(例如,利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑)被轉(zhuǎn) 染進(jìn)宿主細(xì)胞中。
      [0053] 宿主細(xì)胞
      [0054] 本發(fā)明的宿主細(xì)胞可自包含T細(xì)胞、造血干細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、 B細(xì)胞及單核細(xì)胞系(例如,血液單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的細(xì)胞的任何哺乳動物源(例如, 人外周血單核細(xì)胞、骨髓、和/或胸腺,并分離自,例如,受試者自身細(xì)胞或另一個供體源) 衍生。用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體(例如,編碼CIR的核酸構(gòu)建體)轉(zhuǎn)染或感染宿主細(xì)胞。在 給予至患者前,宿主細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增。在一個實(shí)施方案中,將修飾的宿主細(xì)胞給予 至患者,所述宿主細(xì)胞原先分離自所述患者。在另一個實(shí)施方案中,將修飾的宿主細(xì)胞給予 至來自另一源的患者,所述宿主細(xì)胞分離自所述另一源。
      [0055] 病況與病癥
      [0056] 組織學(xué)研究確認(rèn)本發(fā)明的CIR定位于KIT+腫瘤并在靜脈輸注后介導(dǎo)腫瘤壞死。在 一些實(shí)施方案中,必須單次或多次輸注以實(shí)現(xiàn)所移植生長的腫瘤的完全消退。在特定實(shí)施 方案中,添加 IL15和IL21以促進(jìn)效應(yīng)子表型可提供增強(qiáng)本發(fā)明的CIR效力的潛能。在特 定實(shí)施方案中,體內(nèi)模型中腫瘤生長的顯著延遲支持用于治療GIST的本發(fā)明CIR的潛在效 用。在另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的CIR也可用于治療KIT+相關(guān)疾病。KIT+相關(guān)疾病的實(shí)例 包括但不限于:急性骨髓性白血病、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、 骨髓增生性疾?。∕PD)、侵襲性系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥(ASM)、高嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征 (HES)、隆突性皮膚纖維肉瘤(DFSP)、神經(jīng)外胚層源的軟組織肉瘤、和/或表征為KIT過表達(dá) 和/或過度活化的其它疾病。
      [0057] 添加劑和組合治療
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