一種二次親和層析法提取激肽釋放酶原的方法及提高激肽釋放酶原穩(wěn)定性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種應(yīng)用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]激肽釋放酶原是激肽釋放酶的前體，激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它包括血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶兩種類型，均能使激肽原釋放出一種多肽一一激肽，而激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(kallikrein kinin system, KKS)是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一，作為一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應(yīng)、癌癥等疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。
[0003]近年來(lái)在心血管系統(tǒng)方面的研究進(jìn)展很快，許多臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的發(fā)生與KKS的活性降低有關(guān)。因而深入研究KKS的作用為研究心血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供了又一新的途徑。
[0004]本發(fā)明人自2008年開(kāi)始對(duì)胰酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，特別是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生產(chǎn)過(guò)程中，不斷探索，力求優(yōu)化完善工藝參數(shù)，并且在原有工藝的基礎(chǔ)上另辟蹊徑，成功完成提取激肽釋放酶原的工藝研究，其收率為0.2%?0.4%，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了種應(yīng)用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，特別是采用優(yōu)化原有親和層析工藝，得到激肽釋放酶原。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種二次親和層析法提取激肽釋放酶原的方法及提高激肽釋放酶原穩(wěn)定性的藥物組合物，其特征在于:在通過(guò)對(duì)原有工藝的優(yōu)化，提取所得激肽釋放酶原收率為0.2%?0.4%。在發(fā)明技術(shù)方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
1)原料預(yù)處理
胰臟洗凈后，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0007]2)蛋白浸漬提取
2.1)取預(yù)處理過(guò)的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿(必要時(shí)應(yīng)絞3次)，加入胰漿2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次攪拌，浸漬提??；
2.2)浸漬物過(guò)濾后，濾渣再用1倍量的冰冷硫酸重復(fù)上述過(guò)程，再進(jìn)行過(guò)濾，棄濾渣，合并2次濾液，加入硫酸錢，使硫酸錢濃度達(dá)到40%飽和度，冷室放置，過(guò)夜；
2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過(guò)濾，上清液和濾液合并，得提取液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到70%飽和度，冷室放置過(guò)夜。
[0008]3)分級(jí)沉淀 3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過(guò)濾至干，加入3倍于濾餅重的冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40%和70%飽和度分級(jí)沉淀；
3.2)將最后一次70%飽和度沉淀濾餅，加入1.5倍于濾餅重的冰水溶解，并加入0.5倍濾餅重量的飽和硫酸銨溶液。
[0009]4) 一次親和層析
4.1)用適量的0.01-0.3mol/L, PH5-10的Tris_HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
4.2)將混合液流經(jīng)此柱，流速控制在l~5mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；
4.3)平衡后，用0.l-5mol/L的NaCL溶液洗脫完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。
[0010]5) 二次親和層析
5.1)用適量的0.01-0.3mol/L, PH3-8的醋酸鹽緩沖液來(lái)平衡親和層析快膠柱；
5.2)平衡后，用含0.l-3mol/L NaCl的0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在l~5mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰。
[0011]6)結(jié)晶
6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于-20°C冰箱中靜置結(jié)晶22?24h ;
6.2)將結(jié)晶減壓抽濾，干燥后得激肽釋放酶原。
[0012]經(jīng)核算，所得激肽釋放酶原收率約為0.2%?0.4%。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
選用二次親和層析提取激肽釋放酶原，在穩(wěn)定收率的前提下，其理化性質(zhì)和生物活性也保持穩(wěn)定，從而有利于下一步對(duì)激肽釋放酶原進(jìn)行精制，最終使激肽釋放酶的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過(guò)工藝的不斷改進(jìn)和完善，特別是采用二次親和層析優(yōu)化原有工藝，激肽釋放酶原收率0.2%?0.4%，節(jié)約成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而不以任何方式限制。
[0015]實(shí)施例1 1)原料預(yù)處理
胰臟洗凈后，去掉脂肪、結(jié)締組織等雜物，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0016]2)蛋白浸漬提取
2.1)將預(yù)處理過(guò)的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿，稱重后積滿100kg投入反應(yīng)罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每1?2h攪拌1次，浸漬提取24h ;
2.2)浸漬物用粗濾袋(或二層紗布)過(guò)濾，濾干后，得到濾渣86kg。再用86L冰冷硫酸重復(fù)上述過(guò)程，再進(jìn)行過(guò)濾，棄濾渣，合并2次濾液共270L，加入固體硫酸銨65.34kg,使硫酸銨濃度達(dá)到40%飽和度，冷室放置，過(guò)夜；
2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過(guò)濾，上清液和濾液合并，得提取液264L，加入固體硫酸銨54.12kg,使硫酸銨濃度達(dá)到70%飽和度，冷室放置過(guò)夜。
[0017]3)分級(jí)沉淀
3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過(guò)濾至干稱重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40%和70%飽和度分級(jí)沉淀； 3.2)取第二次70%飽和度沉淀濾餅9.6kg，加入14.4L冰水溶解，并加入4.8L飽和硫酸銨溶液。
[0018]4)—次親和層析
4.1)用80L 0.2mol/L, PH8的Tris_HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
4.2)將混合液19.2L流經(jīng)此柱，流速控制在2mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.4L ；
4.3)平衡后，用36.8L 1.5mol/L的NaCL溶液洗脫，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.4L。
[0019]5) 二次親和層析
5.1)用40L的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液來(lái)平衡親和層析快膠柱；
5.2)平衡后，用含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L, PH6的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在4mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰12.5L。
[0020]6)結(jié)晶
6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于-20°C冰箱中靜置結(jié)晶24h