分化細(xì)胞的新型制備方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01080042161. 7 (PCT申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/ JP2010/065903)、申請(qǐng)日為2010年9月15日、發(fā)明名稱為"分化細(xì)胞的新型制備方法"的 發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種制備特定的分化細(xì)胞的方法以及根據(jù)該方法制備的細(xì)胞。尤其， 本發(fā)明涉及一種制備分化的血球細(xì)胞的方法以及根據(jù)該方法制備的血球細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0003] 在為了治療患者而需要特定的細(xì)胞時(shí)，需要確保能夠達(dá)到治療目的的充足數(shù)量的 細(xì)胞。然而，由于從機(jī)體獲取用于治療的充足量的細(xì)胞較為困難，因此嘗試了在機(jī)體外例如 從其前體細(xì)胞等分化誘導(dǎo)目的細(xì)胞而制備的方法等。
[0004] 在治療與血液相關(guān)的疾病時(shí)，或者在進(jìn)行外科治療時(shí)，需要用于治療的血球細(xì)胞。 在血球細(xì)胞中，尤其血小板、前血小板（proplatelet)作為血液凝固（止血）所必須的細(xì) 胞，進(jìn)一步地巨核細(xì)胞作為產(chǎn)生血小板的細(xì)胞，是需求特別大的細(xì)胞。特別是血小板在白血 病、骨髓移植、抗癌治療等方面需要的量較多，且穩(wěn)定供給的必要性高。迄今為止，為了確 保血小板的供給，除了通過從獻(xiàn)血者的血液中提取的方法外，采用了給予如TPO的類似物 (mimetics)制劑的方法、從臍帶血或骨髓細(xì)胞分化出巨核細(xì)胞的方法等。進(jìn)一步地，嘗試 了在機(jī)體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞，從這些前體細(xì)胞制備血球細(xì)胞的方法等。例 如，目前報(bào)道有從小鼠 ES細(xì)胞建立造血干細(xì)胞株的方法（專利文獻(xiàn)1)、從靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚 胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的方法（專利文獻(xiàn)2)或者在機(jī)體外簡(jiǎn)便且穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增維持造血 干細(xì)胞的未分化性的CD34陽性/CD38陰性細(xì)胞的方法（專利文獻(xiàn)3)等。
[0005] 并且，在分化誘導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，多功能干細(xì)胞的有用性很高。ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞等多功 能干細(xì)胞能夠作為人工制備血小板等血球細(xì)胞的來源（source)而利用。近年來，由于iPS 細(xì)胞的建立，多功能干細(xì)胞的有用性在再生醫(yī)療中作為細(xì)胞療法的重要來源而進(jìn)一步受到 了關(guān)注。迄今為止，例如Takayama等人成功地從人類ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)出巨核細(xì)胞以及血小 板，其結(jié)果，出現(xiàn)了作為血小板輸血源而利用從ES細(xì)胞分化的血小板的可能性（專利文獻(xiàn) 4以及非專利文獻(xiàn)1)。進(jìn)一步地，發(fā)明者們已確立從iPS細(xì)胞制備巨核細(xì)胞以及血小板的 方法，可以解決在ES細(xì)胞來源的血小板的輸血中難以回避的白血球抗原（human leukocyte antigen，HLA(人類白細(xì)胞抗原））的相容性問題。并且，以往，對(duì)于從獻(xiàn)血者的血液提供的 血小板而言，由于獻(xiàn)血人數(shù)的持續(xù)不足等而難以穩(wěn)定地供給充足的血小板，對(duì)于該問題，也 認(rèn)為可以通過從ES細(xì)胞或者iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)血小板而解決。但是，在迄今為止的方法中， 從iPS細(xì)胞或者ES細(xì)胞制備的血小板由于制備量較少，且每次制造時(shí)都要通過一系列工藝 才能制備，因此目前期望將以往的方法改善成確保血小板量的穩(wěn)定性的有效的方法。
[0006] 為了穩(wěn)定地提供充足的這種巨核細(xì)胞和血小板等血球細(xì)胞而需要解決的問題，可 以說在其他細(xì)胞的供給中也存在。
[0007] 在通過細(xì)胞分化誘導(dǎo)而制備期望的細(xì)胞時(shí)，同樣由于不容易大量制備期望的細(xì)胞 的前體細(xì)胞，因此在目前階段，最終難以確保充足量的分化的期望細(xì)胞。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2006-141356號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2004-350601號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2006-61106號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn) 4 :TO2008/041370
[0014] 非專利文獻(xiàn)
[0015] 非專利文獻(xiàn) I :Takayama 等，Blood, 111:5298-53062008

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 技術(shù)問題
[0017] 雖然本發(fā)明的發(fā)明者們已確立關(guān)于血球細(xì)胞的從iPS細(xì)胞獲得巨核細(xì)胞以及血 小板的方法，但是在將該方法臨床應(yīng)用時(shí)，需要改善成能夠大量產(chǎn)生巨核細(xì)胞以及血小板 的方法。并且，如果著眼于將來的臨床應(yīng)用，則能夠迅速應(yīng)對(duì)血小板的供應(yīng)需要，并且可以 進(jìn)行穩(wěn)定的供應(yīng)，也是重要的因素。
[0018] 因此，鑒于上述方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法為了通過分化誘導(dǎo)細(xì)胞而制備 目的細(xì)胞，提高處于期望的分化階段的細(xì)胞的增殖能力，擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)，從該細(xì)胞制備目的細(xì) 胞。
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明通過使用上述方法而提供期望的分化的血球細(xì)胞。尤其，本發(fā)明 提供成為成熟巨核細(xì)胞和血小板來源（source)的、作為血球細(xì)胞的、增殖能力高的巨核前 體細(xì)胞及其制備方法。
[0020] 并且，本發(fā)明的目的在于，提供從該巨核前體細(xì)胞大量且穩(wěn)定地制備成熟巨核細(xì) 胞和血小板的方法，以及通過這些方法制備的成熟巨核細(xì)胞以及從該成熟巨核細(xì)胞分化誘 導(dǎo)的血小板。
[0021] 并且，由于對(duì)于紅血球細(xì)胞也指出了與血小板同樣地穩(wěn)定供給的必要性，因此提 供紅血球細(xì)胞的制備方法以及通過該方法制備的紅血球，也作為本發(fā)明的目的。
[0022] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的在于，提供一種長(zhǎng)期保藏作為成熟巨核細(xì)胞的未成熟狀 態(tài)的細(xì)胞的巨核前體細(xì)胞的方法，該成熟巨核細(xì)胞作為血小板的前體細(xì)胞。
[0023] 技術(shù)方案
[0024] 發(fā)明者們比較通過四種基因（0ct3/4, S0X2, KLF-4, c-MYC)建立的iPS細(xì)胞和通 過除了 c-MYC的三種基因（0ct3/4，S0X2，KLF-4)建立的iPS細(xì)胞的巨核細(xì)胞以及血小板產(chǎn) 生能力，明確了通過四種基因的iPS細(xì)胞更有意義且有效地產(chǎn)生巨核細(xì)胞以及血小板。進(jìn) 一步地，明確了建立時(shí)導(dǎo)入的四種基因的表達(dá)雖然在iPS細(xì)胞狀態(tài)下被抑制，但是伴隨巨 核細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)了 c-MYC基因的再活化，參與巨核細(xì)胞的產(chǎn)生量的增加。進(jìn)一步地，還 明確了使c-MYC基因強(qiáng)制性表達(dá)的多核化前的巨核前體細(xì)胞獲得高的增殖能力。
[0025] 并且，一般使c-MYC等癌基因在細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，會(huì)加快細(xì)胞周期，使增殖活躍進(jìn) 行。已知，細(xì)胞對(duì)該增殖作為壓力而捕獲，誘導(dǎo)抑制該增殖的防御反應(yīng)（oncogene-induced senescence，OIS :癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老），抑制過剩的細(xì)胞增殖。本發(fā)明的發(fā)明者等人進(jìn) 一步著眼于該現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控處于分化階段的細(xì)胞的OIS而大量制備特定分化的細(xì)胞 的方法。
[0026] 本發(fā)明是基于以上見解而完成的。
[0027] BP，本發(fā)明涉及以下⑴~（30)。
[0028] (1) -種特定細(xì)胞的制備方法，該方法是分化誘導(dǎo)細(xì)胞而制備特定細(xì)胞的方法，其 中，為了擴(kuò)增期望的分化階段的細(xì)胞，在該期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)使癌基因強(qiáng)制表達(dá)。
[0029] (2)如上述（1)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，抑制由于在期望的分化 階段的細(xì)胞內(nèi)使癌基因強(qiáng)制表達(dá)而誘導(dǎo)的、癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老。
[0030] (3)如上述⑴或⑵所述的特定細(xì)胞的制備方法，所述癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老的 抑制是通過使多梳基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
[0031] (4)如上述（1)至（3)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述 期望的分化階段的細(xì)胞是從胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞。
[0032] (5)如上述（1)至（4)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，在所 述期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使該癌基因、或 者該癌基因以及該多梳基因強(qiáng)制表達(dá)。
[0033] (6)如上述（5)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，在期望的分化階段的細(xì) 胞的前體細(xì)胞中導(dǎo)入所述外源癌基因或者多梳基因，使該癌基因、或者該癌基因以及該多 梳基因強(qiáng)制表達(dá)。
[0034] (7)如上述（5)或（6)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將所述癌基因和 /或多梳基因分別可發(fā)揮作用地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，使該癌基因、或者該癌基因以 及該多梳基因誘導(dǎo)性強(qiáng)制表達(dá)。
[0035] (8)如上述（5)至（7)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，為了 促進(jìn)所述期望的分化階段的細(xì)胞的分化，抑制該期望的分化階段的細(xì)胞內(nèi)的癌基因或者、 癌基因以及多梳基因的表達(dá)。
[0036] (9)如上述（8)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述癌基因、或者癌基 因以及多梳基因的表達(dá)抑制是，通過分別可發(fā)揮作用地連接到抑制型啟動(dòng)子的下游，抑制 該基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
[0037] (10)如上述⑴至（9)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述 癌基因?yàn)镸YC家族基因。
[0038] (11)如上述（3)至（10)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所 述多梳基因?yàn)锽MIl基因。
[0039] (12)如上述（6)至（11)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所 述期望的分化階段的細(xì)胞的前體細(xì)胞是造血前體細(xì)胞，所述期望的分化階段的細(xì)胞是多核 化前的巨核前體細(xì)胞，所述特定細(xì)胞是成熟巨核細(xì)胞。
[0040] (13)如上述（6)至（11)中任意一項(xiàng)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所 述期望的分化階段的細(xì)胞的前體細(xì)胞是造血前體細(xì)胞，所述期望的分化階段的細(xì)胞是多核 化前的巨核前體細(xì)胞，所述特定細(xì)胞是血小板。
[0041] (14)如上述（12)或（13)所述的特定細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述造血前體 細(xì)胞是存在于從胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制備的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物內(nèi)的細(xì)胞。
[0042] (15) -種成熟巨核細(xì)胞，該成熟巨核細(xì)胞是如上述（12)或（14)所述的特定細(xì)胞。
[0043] (16) -種血小板，該血小板是如上述（13)或（14)所述的特定細(xì)胞。
[0044] (17) -種血液制劑，該血液制劑將記載于上述（16)的血小板作為有效成分。
[0045] (18) -種試劑盒，用于制備如上述（15)或（16)所述的成熟巨核細(xì)胞或者血小板。
[0046] (19) -種強(qiáng)制表達(dá)癌基因的期望的分化階段的血球細(xì)胞。
[0047] (20)如上述（19)所述的血球細(xì)胞，進(jìn)一步強(qiáng)制表達(dá)多梳基因。
[0048] (21)如上述（19)或（20)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，所述期望的分化階段的血 球細(xì)胞是從胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞。
[0049] (22)如上述（19)至（21)中任意一項(xiàng)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，在所述期望的 分化階段的血球細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使癌基因、或者癌基 因以及多梳基因強(qiáng)制表達(dá)。
[0050] (23)如上述（22)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，將所述外源癌基因或者多梳基因 導(dǎo)入到期望的分化階段的血球細(xì)胞的前體細(xì)胞內(nèi)，使該癌基因、或者該癌基因以及該多梳 基因強(qiáng)制表達(dá)。
[0051] (24)如上述（22)或（23)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，將所述癌基因和/或多梳 基因分別可發(fā)揮作用地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，使該癌基因、或者該癌基因以及該多 梳基因誘導(dǎo)性強(qiáng)制表達(dá)。
[0052] (25)如上述（19)至（24)中任意一項(xiàng)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，所述癌基因?yàn)?MYC家族基因。
[0053] (26)如上述（20)至（25)中任意一項(xiàng)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，所述多梳基因 為BMIl基因。
[0054] (27)如上述（23)至（26)中任意一項(xiàng)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，所述期望的分 化階段的血球細(xì)胞的前體細(xì)胞是造血前體細(xì)胞，所述期望的分化階段的血球細(xì)胞是多核化 前的巨核前體細(xì)胞。
[0055] (28)如上述（27)所述的血球細(xì)胞，其特征在于，所述造血前體細(xì)胞是存在于從胚 胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制備的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物內(nèi)的細(xì)胞。
[0056] (29) -種冷凍細(xì)胞組合物，包含