一種分離純化胰蛋白酶的方法及提高胰蛋白酶復(fù)溶性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及純化胰蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近(23300)，其等電點(diǎn)約為ρΗΙΟ.8，最適pH7.6?8.0，在pH=3時(shí)最復(fù)溶，低于此pH時(shí)，胰蛋白酶易變性，在pH>5時(shí)易自溶；Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有復(fù)溶作用。
[0003]胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。
[0004]胰蛋白酶作為蛋白酶的一種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。
[0005]此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用于治療毒蛇咬傷，也常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理。
[0006]用傳統(tǒng)的方法僅提取胰蛋白酶是相當(dāng)困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582.0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產(chǎn)品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請(qǐng)了一種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了 CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經(jīng)過(guò)洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產(chǎn)品均為糜胰蛋白酶，沒有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是將提取的胰蛋白酶純化，得到較高純度的胰蛋白酶。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明成本低，產(chǎn)品胰蛋白酶效價(jià)高，適合于規(guī)?；a(chǎn)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將胰蛋白酶粗品溶解后，經(jīng)鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經(jīng)結(jié)晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟:
(1)投料:稱取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2?4ml的水?dāng)嚢枞芙猓{(diào)節(jié)pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10?16小時(shí)；計(jì)量溶液體積，按400?500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10?16小時(shí)；
(2)鹽溶:將溶液過(guò)濾，稱量濾餅重量，先按每克濾餅加入2~4ml的水，攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1?3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10?16小時(shí)； (3)鹽析:將溶液過(guò)濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10?16小時(shí)；
(4)洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；
(5)活化:稱濾餅重量為A千克，將濾餅溶于3A?5A升的0.001?0.01mol/L鹽酸溶液，另加入0.5?2mol/L氯化鈣溶液A?3A升及pH7.5?8.5硼酸緩沖液4A?6A升，再加入6A?9A升的水，調(diào)節(jié)pH至7.0?8.0，最后每克濾餅加5?15mg的結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行活化，將溶液置0?10°C中靜置60?80小時(shí)進(jìn)行活化，pH控制在7.0?8.0 ;
(6)除鈣:活化后的溶液，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0?10°C中存放32?60小時(shí)使硫酸鈣沉淀，過(guò)濾，濾液按150?250g/L加入固體硫酸銨，在0?10°C中靜置10?14小時(shí)，過(guò)濾，得濾餅；
(7)結(jié)晶:按每克濾餅加入1?2mlpH8.0?10.0硼酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，0?10°C時(shí)浸于外透液中，結(jié)晶3?7天;
(8)透析:取出結(jié)晶液過(guò)濾得結(jié)晶物，再按每克結(jié)晶物加入1?3ml水溶解，調(diào)節(jié)pH至
3.0±0.5 ;將溶液透析2?4天，去除雜質(zhì)，每10?14小時(shí)左右透析池?fù)Q水一次，溫度控制在0?10°C ；
(9)凍干:取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調(diào)節(jié)pH至6.0±0.4，進(jìn)凍干機(jī)凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
實(shí)施例1
1.投料
1.1稱取胰蛋白酶粗品100.0g,先用300ml純化水?dāng)嚢枞芙猓?.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，以助其溶解，攪拌12小時(shí)；
1.2計(jì)量溶液體積298.4ml，加入固體硫酸銨140.9g，待其溶解后，靜置沉淀12小時(shí)；
1.3將溶液真空過(guò)濾，稱量濾餅重量96.6g，加純化水289.9ml，攪拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，加入飽和硫酸銨溶液193.2ml，靜止沉淀12小時(shí)；
1.4將溶液過(guò)濾，量取濾液體積479.3ml，加入飽和硫酸銨溶液479.3ml，靜置沉淀12小時(shí)；
1.5洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重93.3g，待活化。
[0010]2.活化
將濾餅溶于373.2ml0.005mol/L鹽酸溶液，另加入lmol/L氯化鈣溶液186.6ml及ρΗ8.0硼酸緩沖液466.5ml，再加入746.4ml純化水，調(diào)節(jié)pH至7.4，最后加933mg活力較高的結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行活化處理，將溶液在5?10°C中靜置72小時(shí)進(jìn)行活化，第二天測(cè)pH值為7.4。
[0011]3.除鈣活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.1，溶液體積為1873ml，再加入固體硫酸銨455.2g，攪拌溶解，在0?10°C中存放48小時(shí)使硫酸鈣沉淀，過(guò)濾，濾液加入固體硫酸銨369.0g，在0?10°C靜置12小時(shí)，過(guò)濾，得濾餅重量45.6g。
[0012]4.結(jié)晶
濾餅加入pH9.0硼酸緩沖液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5?10°C浸于外透液中，結(jié)晶5天，每2小時(shí)搖包一次。
[0013]5.透析
取出結(jié)晶液過(guò)濾得結(jié)晶物28.7g，加純化水43.lml溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至
3.0 ;將溶液裝透析袋，然后掛于透析池中透析3天，去除鹽類雜質(zhì)，每12小時(shí)左右透析池?fù)Q水一次，溫度控制在5?10°C。
[0014]6.凍干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，進(jìn)凍干機(jī)凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品6.2g，經(jīng)測(cè)定其活性效價(jià)為2600iu/mg。
[0015]實(shí)施例2 1.投料
1.1稱取胰蛋白酶粗品120.0g,先用300ml純化水?dāng)嚢枞?