用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的引物組合及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的引物組合及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌病是造成世界各地家禽業(yè)高發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要病因。禽大腸桿 菌病是由大腸埃希氏菌（Escherichia coli)的某些致病性血清型引起的細(xì)菌性傳染病。常 引起繼發(fā)性局部或全身性感染，可引起敗血癥、大腸桿菌性腹膜炎、心包炎、肝周炎、輸卵管 炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、肉芽腫、眼炎等多種病變。近年來(lái)報(bào)道大腸桿菌病還可引起腦型 感染和腫頭綜合征。該病常與其他細(xì)菌病、病毒病、寄生蟲(chóng)病等混合感染造成死亡率升高， 給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的損失。
[0003] 由于大腸桿菌的血清型較多，一直以來(lái)在禽源大腸桿菌分離株的血清型方面研究 較多，對(duì)于禽源大腸桿菌分離株的毒力基因與致病力之間關(guān)系的了解相對(duì)較少。而血清 型鑒定只能初步判定有限血清型的禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)分離株，因此，目前確定APEC分離株的致病力主要通過(guò)動(dòng)物致死性試驗(yàn)加以判 定，這種方法不僅消耗大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且耗時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢(qián)，有違動(dòng)物福利，增加了實(shí)驗(yàn) 成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了提高APEC分離株的致病力預(yù)判的效率，本發(fā)明提供了用于快速判定禽源大 腸桿菌分離株致病力的引物組合及試劑盒。采用本發(fā)明的引物組合及試劑盒，通過(guò)一種雙 重PCR和單一 PCR的檢測(cè)方法可快速判定禽源大腸桿菌分離株的致病力。
[0005] 本發(fā)明旨在建立禽致病性大腸桿菌（APEC)毒力基因與致病力之間的關(guān)系，根據(jù) 已發(fā)表的大腸桿菌毒力基因的序列，對(duì)APEC分離株的32個(gè)毒力基因的檢測(cè)結(jié)果表明，致病 株比非致病株出現(xiàn)頻率高（Ρ〈〇· 05)的有 iucC、iucD、iutA、tsh、iroN、irp-2、iss 和 cvaC 這8個(gè)毒力相關(guān)基因。氣桿菌素合成基因 iucC、iucD與編碼氣桿菌素受體的基因 iutA處 于一個(gè)操縱子上，iucC和iucD的檢出率幾乎一樣，而iutA基因在致病株與非致病株的檢 出率間存在顯著差異，我們選擇保留iutA基因。因此，本發(fā)明建立iutA、iss、tsh、iroN、 irp-2、cvaC這6個(gè)基因的檢測(cè)模式來(lái)判定APEC。
[0006] 再根據(jù)對(duì)89個(gè)禽源大腸桿菌分離株的致病性試驗(yàn)結(jié)果（表1)，結(jié)合這些分離株毒 力基因的檢測(cè)結(jié)果，得出：
[0007] (1)在受檢的6個(gè)毒力基因中，若分離株毒力基因數(shù)多2 ;分離株屬致病株的概率 為：63 + 68 = 92. 64%? 93%
[0008] (2)在受檢的6個(gè)毒力基因中，若分離株毒力基因數(shù)〈2,分離株屬非致病株的概率 為：12 + 21 = 57. 14%? 57%〇
[0009] 表1 89個(gè)APEC分尚株毒力基因數(shù)量與致病性之間的關(guān)系
[0011] 基于以上結(jié)果，建立基于毒力基因數(shù)量預(yù)測(cè)禽源大腸桿菌分離株致病性的方法。
[0012] 本發(fā)明一方面提供了用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的引物組合，該引 物組合是由6對(duì)引物組成，所述的6對(duì)引物分別是大腸桿菌iss、iroN、tsh、cvaC、iutA和 irp2這6個(gè)基因的特異引物。
[0013] 所述的大腸桿菌iss、iroN、tsh、cvaC、iutA和irp2基因的6對(duì)引物，其序列分別 如 SEQ ID No. 1 和 2, SEQ ID No. 3 和 4, SEQ ID No. 5 和 6, SEQ ID No. 7 和 8, SEQ ID No. 9 和 10, SEQ ID No. 11 和 12 所示。
[0014] 本發(fā)明還提供一種用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的PCR試劑盒，該試 劑盒包括上述引物組合及常規(guī)PCR試劑。所述PCR試劑為10 X buffer、MgCl2 (25mmol/L)、 dNTPs (2. 5mmol/L)、Taq DNA 聚合酶（500U)及超純水。
[0015] 采用本發(fā)明引物組合或試劑盒進(jìn)行靶基因的特異性擴(kuò)增，完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 鑒定，確定大腸桿菌分離株所含毒力基因的數(shù)量，從而快速鑒定APEC分離株的致病力。 在受檢的6個(gè)毒力基因中，若分離株毒力基因數(shù)多2,判定該分離株為禽致病性大腸桿菌 (APEC) 〇
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用合成的6對(duì)引物對(duì)相應(yīng)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò) 增的靶基因片段數(shù)量來(lái)快速判定分離株的致病力。本研究建立的方法可用于預(yù)判禽源大腸 桿菌的致病力，只有需確證上述分離株致病力的情形下，才需考慮動(dòng)物試驗(yàn)。因此，與傳統(tǒng) 的動(dòng)物試驗(yàn)相比，本發(fā)明不但減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，同時(shí)改善了動(dòng)物福利，縮短了實(shí)驗(yàn)周 期。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明中致病菌株和非致病菌株的定義：
[0018] 致病菌株：以I X IO7菌落形成單位（colony forming units, CFU)的禽源大腸桿 菌分離株氣管或氣囊接種1日齡易感雞5-6羽，連續(xù)觀察1周，能引起接種雞死亡的分離株 為致病菌株。
[0019] 非致病菌株：以I X IO7菌落形成單位（colony forming units, CFU)的禽源大腸 桿菌分離株氣管或氣囊接種1日齡易感雞5-6羽，連續(xù)觀察1周，不能引起接種雞死亡的分 離株為非致病菌株。
[0020] 采用本發(fā)明引物組合進(jìn)行預(yù)測(cè)禽源大腸桿菌分離株致病力的方法如下：
[0021] (1)引物的設(shè)計(jì)
[0022] 引物序列如表2:
[0023] 表2發(fā)明所涉引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段大小
[0025] (2) DNA模版的制備
[0026] 通過(guò)全菌裂解法進(jìn)行細(xì)菌DNA模板的制備。在LB固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接 種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/min搖振培養(yǎng)過(guò)夜，取適量于指形管中，12000rpmX 5min 離心，棄去殘存培養(yǎng)基，瞬離，吸干，用去離子水懸浮沉淀，置l〇〇°C lOmin，冰浴lOmin， 12000rpmX IOmin離心，取上清即為DNA模板。
[0027] (3) PCR擴(kuò)增毒力基因片段
[0028] 6個(gè)毒力基因 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序如下：
[0029] iss、iroN 毒力基因的雙重 PCR 擴(kuò)增體系：10Xbuffer 2. 5 μ UMgCl2L 5 μ L、 (1犯138〇.5 4 1^、丁&1〇嫩聚合酶0.5 4 1^、超純水16 4 1^引物188-卩、188-1?各0.5 4 1^，化(^-卩、 化〇11?各0.5以1^濃度為2(^111〇1/1111)，2以1^0嫩模板。反應(yīng)程序：首先94°(：預(yù)變性41^11 ; 然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，條件為94°C lmin，55°C lmin、72°C Imin ;最后72°C延伸lOmin。同時(shí) 以標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌超純水作空白對(duì)照。
[0030] tsh、cvaC 毒力基因的雙重 PCR 擴(kuò)增體系：10Xbuffer 2. 5 μ UMgCl2L 5 μ L、 dNTPs 0· 5 yL、Taq DNA 聚合酶 0· 5 yL、超純水 16 yL，引物 tsh-F、tsh-R 各 0· 5 yL，cvaC-F、 cvaC-R各0. 5 μ L (濃度為20 μ mol/ml)，2 μ LDNA模板。反應(yīng)程序：首先94°C預(yù)變性4min ; 然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，條件為94°C lmin，55°C lmin、72°C Imin ;最后72°C延伸lOmin。同時(shí) 以標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌超純水作空白對(duì)照。
[0031] iutA 毒力基因的 PCR 擴(kuò)增體系：10Xbuffer 2. 5 μ L、MgCl2L 5 μ L、dNTPs 0.5yL、Taq DNA 聚合酶 0.5yL、超純水 17yL，弓丨物 iutA-F、iutA-R 各 0.5yL(濃度為 20以111〇1/1111)，2以0)嫩模板。反應(yīng)程序：首先94°(：預(yù)變性41^11;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，條件 為94°C 30s，63°C 30s，72°C Imin ;最后72°C延伸lOmin。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照，以滅 菌超純水作空白對(duì)照。
[0032] irP2 毒力基因的 PCR 擴(kuò)增體系：10Xbuffer 2. 5 μ L、MgCl2L 5 μ L、dNTPs 0.5yL、Taq DNA 聚合酶 0.5yL、超純水 17yL，弓丨物 irP2-F、irP2-R 各 0.5yL(濃度為 20以111〇1/1111)，2以0)嫩模板。反應(yīng)程序：首先94°(：預(yù)變性41^11;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，條件 為94°C 30s，59°C 30s，72°C Imin ;最后72°C延伸lOmin。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性對(duì)照，以滅 菌超純水作空白對(duì)照。
[0033] (4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
[0034] 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μ 1，點(diǎn)樣于1 %瓊脂糖凝膠（含0. 5 μ g/mL溴化乙錠），以5V/ cm的電場(chǎng)強(qiáng)度于0. 5 X TBE緩沖液中電泳，以IOObp Ladder marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照，凝膠成 像系統(tǒng)拍照，確定待檢分離株擁有6個(gè)受檢毒力基因的數(shù)量，如果分離株的上述毒力基因 數(shù)不小于2個(gè)，即可判定該分離株具有致病性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的引物組合，其特征在于，是由6對(duì)引物 組成，所述的6對(duì)引物分別是大腸桿菌iss、iroN、tsh、cvaC、iutA和irp2這6個(gè)基因的特 異引物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述的6對(duì)引物，其序列如SEQID No. 1和 2,SEQIDNo. 3 和 4,SEQIDNo. 5 和 6,SEQIDNo. 7 和 8,SEQIDNo. 9 和 10,SEQ IDNo. 11 和 12 所示。3. -種用于快速預(yù)判定禽源大腸桿菌分離株致病力的PCR試劑盒，其特征在于包括權(quán) 利要求1所述的引物組合以及PCR試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所的試劑盒，其特征在于，所述的PCR試劑是10Xbuffer、25mmol/L 的MgCl2、2. 5mmol/LdNTPs、500U的TaqDNA聚合酶及超純水。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于快速預(yù)判禽源大腸桿菌分離株致病力的引物組合及試劑盒。所述引物組合是大腸桿菌iss、iroN、tsh、cvaC、iutA和irp2這6個(gè)基因的特異引物，它們的序列分別如SEQ？ID？No.1和2，SEQ？ID？No.3和4，SEQ？ID？No.5和6，SEQ？ID？No.7和8，SEQ？ID？No.9和10，SEQ？ID？No.11和12所示。包含上述引物組合的PCR試劑盒，對(duì)相應(yīng)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增的靶基因片段數(shù)量來(lái)快速判定分離株的致病力。本發(fā)明可用于預(yù)判禽源大腸桿菌的致病力，與傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)相比，本發(fā)明不但減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，同時(shí)改善了動(dòng)物福利，縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105385685
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510919559
【發(fā)明人】高崧, 董向磊, 高清清, 曹春光, 張翠翠
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年12月11日