一種稻米dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種稻米DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國既是一個(gè)糧食生產(chǎn)大國，也是糧食消費(fèi)大國。進(jìn)入2012年以來，我國大米進(jìn) 口逐月加快。2012年，我國進(jìn)口大米數(shù)量為236. 9萬噸，較2011年56. 9萬噸出現(xiàn)了大幅增 加，創(chuàng)歷史最高水平，從進(jìn)口數(shù)量來看，我國已成為全球第二大大米進(jìn)口國。2013年1-5月 份，我國累計(jì)進(jìn)口大米115. 4萬噸，較上年同期的96. 6萬噸繼續(xù)出現(xiàn)增加態(tài)勢。
[0003] 在大米進(jìn)口中，往往涉及到品種真實(shí)性和純度鑒定、轉(zhuǎn)基因檢測以及秈粳性鑒定 等。PCR技術(shù)在這些方面具有客觀準(zhǔn)確的特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。而從大米中抽提出質(zhì) 量可靠的DNA是進(jìn)行PCR檢測的前提。在種子中大都含有大量的淀粉及一些種類繁多的次 生物質(zhì)，獲得的DNA溶液常常黏度大乃至呈膠狀，主要原因是蛋白質(zhì)、多糖、酚類在提取過 程中與DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠膠狀物，難以溶解或產(chǎn)生褐變，使得DNA提取質(zhì)量 較低，提取液往往含有多糖、色素等物質(zhì)，如清除不凈則無法用于后續(xù)研究。
[0004] 常用的DNA簡易提取方法有堿處理法、高溫水煮法等。這些簡易提取方法大都速 度快、成本低，但是DNA提取質(zhì)量差、保存時(shí)間短、PCR擴(kuò)增效果差。在眾多DNA提取方法中， CTAB法以及基于CTAB的改良抽提方法在不同種屬的植物以及不同組織器官（包括根、莖、 葉、種子等部位）都能抽提到適用于PCR檢測的DNA。但是CTAB法其成本高、毒性較大、且 操作煩瑣、耗時(shí)長。因此，需要研發(fā)無毒、簡便、并且PCR擴(kuò)增效果好，能較長時(shí)間保存的米 粒DNA抽提方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種稻米DNA的提取方法， 該提取方法能夠無毒、簡便地從稻米中抽提出適用于PCR檢測，并能長期保存的DNA。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了如下具體的技術(shù)方案：
[0007] -種稻米DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0008] (1)、取大米粉末，加入DNA提取液，置于75°C水浴30-40min ;所述DNA提取液為： IOOmM pH8. 0 的 Tris-HCl，IOmM pH8. 0 的 EDTA，IM KCl ;
[0009] (2) U0000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心8-10min，取上清液，加入ρΗ5· 2的3Μ醋酸鈉混勻， 然后加入_20°C異丙醇混勻，_20°C放置20-30min ;
[0010] (3)、10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8min，棄上清；沉淀物用70-75 %的乙醇洗滌， 離心后晾干；
[0011] (4)、加入滅菌雙蒸水或1XTE，4°C保存，即得。
[0012] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（1)中大米粉末與加入的DNA提取液的比為 0· lg/0. 9ml 〇
[0013] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（1)中所述水浴的溫度為75°C，水浴時(shí)間為35min。
[0014] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（2)中上清液與加入的醋酸鈉的體積比為3:1。
[0015] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（2)中上清液與加入的異丙醇的體積比為1:1。
[0016] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（2)中10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min。
[0017] 在其中一些實(shí)施例中，步驟（3)中10000轉(zhuǎn)/分鐘離心8min。
[0018] 在其中一些實(shí)施例中，所述稻米DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0019] (1)、取0.1 g大米粉末，加入0. 9ml DNA提取液，置于75°C水浴30-40min ;
[0020] (2)、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，取450 μ L上清液，加入150 μ LpH5. 2的3M醋酸 鈉混勻，然后加入450 μ L-20°C異丙醇混勻，-20°c放置20-30min ;
[0021] (3)、10000轉(zhuǎn)/分鐘離心8min，棄上清；沉淀物用70%的乙醇洗滌1次，離心后晾 干；
[0022] (4)、加入滅菌雙蒸水或1XTE，4°C保存，即得。
[0023] 與常用的CTAB法抽提DNA方法相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0024] (1)本發(fā)明的稻米DNA的提取方法整個(gè)DNA提取過程都不涉及到有毒藥品，因此， 本發(fā)明方法是無毒的，而CTAB提取方法中會(huì)使用到西曲溴銨（CTAB)、氯仿、β-巰基乙醇、 酸等有毒藥品；
[0025] (2)本發(fā)明的稻米DNA的提取方法操作程序簡便，所用試劑種類少，經(jīng)典CTAB法提 取DNA需要的試劑有10多種，而且操作步驟超過10步，過程繁瑣，而本發(fā)明的DNA提取方 法，僅需要8種常用試劑，主要操作程序?yàn)樗?，沉淀DNA以及純化，操作簡便；
[0026] (3)本發(fā)明的稻米DNA的提取方法提取的DNA質(zhì)量較高，提取的DNA的OD26q/ OD28。~2. 0, OD 26Q/0D23。> 2. 0, PCR擴(kuò)增效果好，DNA能長期保存。
【附圖說明】
[0027] 圖1為試驗(yàn)例2中采用6對引物的PCR擴(kuò)增帶型，其中泳道1-8分別為：華粳秈 74、粵晶絲苗2號、吉豐優(yōu)512、]?8、]\110、]\111、]\112和]\113 ;所用擴(kuò)增引物依次為41-八6;
[0028] 圖2為試驗(yàn)例3中采用6對引物的PCR擴(kuò)增帶型，其中泳道1-8分別為：華粳秈 74、粵晶絲苗2號、進(jìn)口米樣品1、進(jìn)口米樣品2、進(jìn)口米樣品3、M11、M12和M13 ;所用擴(kuò)增引 物依次為B1-B6。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未 注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，所采用的技術(shù)手段通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0030] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0031] 實(shí)施例1 一種稻米DNA的提取方法
[0032] 具體包括如下步驟：
[0033] (1)、取大米樣品，用旋風(fēng)式研磨儀磨成粉末；
[0034] (2)、稱取0· Ig米粉，放入2. Oml滅菌的離心管中，加入900 yL DNA提取液（IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)，IOmM EDTA(pH8. 0)，IM KC1)，然后將離心管放入 75 °C 水浴鍋中水浴 3〇-40min ；
[0035] (3) 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，取450 μ 1上清液轉(zhuǎn)入I. 5ml滅菌離心管中，加入 150 μ I 3M醋酸鈉（CH3C00Na，pH5. 2)混勻，然后加入450 μ 1冰凍的異丙醇（_20°C )混勻， 放入-20°C冰箱放置20-30min ;
[0036] (4) 10000轉(zhuǎn)/分