一種深海新型低溫耐鹽酯酶及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種深海細(xì)菌來源低溫耐鹽酯酶、其編碼基 因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂類水解酶是一類能夠催化酯類化合物的水解和合成的酶。根據(jù)脂類水解酶的生 化特征和序列特征，微生物來源的脂類水解酶主要分為8大家族。大多數(shù)脂類水解酶的活 性位點(diǎn)Ser附近有一段相似的氨基酸序列Gly-x-Ser-x-Gly，但第II家族的活性位點(diǎn)附近 序列為Gly-Asp-Ser-Leu(⑶SL)，因此該家族又稱為⑶SL家族。由于其結(jié)構(gòu)的可變性，⑶SL 家族酯酶通常具有多種水解功能和較寬的底物譜，GDSL家族酯酶具有脂肪酶、蛋白酶、硫酯 酶、磷脂酶、芳香酯酶和?；D(zhuǎn)移等多種活性，在工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用潛力。
[0003] 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)特別是測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，微生物全基因組測(cè)序 已十分廉價(jià)和高效?；谌蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)并利用生物信息學(xué)分析手段，直接從基因組序 列中獲得酶基因成為了獲得新型酶的一種重要方法，稱為"in silicon分析"。
[0004] 低溫酯酶由于在低溫下具有較高或最好的活性，在食品風(fēng)味改良和廢水處理等工 業(yè)中比高溫酯酶更具應(yīng)用潛力，已受到廣泛關(guān)注。海洋中大部分區(qū)域?yàn)榈蜏丨h(huán)境，微生物在 海洋環(huán)境中演化出了適應(yīng)低溫的獨(dú)特代謝方式，因此海洋微生物是低溫酯酶的巨大寶庫(kù)。 目前授權(quán)的低溫細(xì)菌酯酶專利還較少。中國(guó)專利201110208211. 0提供了一種深海沉積物 來源的低溫酯酶，其最適反應(yīng)條件為20°C，最適催化底物為對(duì)硝基苯酚丁酸酯。此外，中 國(guó)專利201510015698. 7提供了一種最適反應(yīng)條件為45°C的海洋來源適冷酯酶，該酯酶在 20°C以下具有較高催化活性和穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新的深海細(xì)菌來源酯酶、其編碼基因及其制備方法，該 酯酶可用于酯類降解及其他酯類化合物的生物催化和轉(zhuǎn)化。
[0006] 本發(fā)明針對(duì)分離自深海沉積物的細(xì)菌Croceicoccus marinus E4A9T(公眾可以 從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買獲得），基于全基因組序列分析篩選獲得酯酶 基因 elO,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。酯酶基因 elO大小為618bp，堿基組成為： 106Α(17· 15%)、97Τ(15· 70% )、203C(32. 85% )和 212G(34. 30% )，編碼蛋白大小為 205個(gè) 氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。將該酯酶序列在GenBank中進(jìn)行同源搜 索，與之相似性最高的是同屬細(xì)菌Croceicoccus naphthovorans中的酯酶，相似性為64% (其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)為WP_047820200)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，酯酶ElO屬 于酯酶家族中的第II家族。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，酯酶ElO活性位點(diǎn)絲氨酸附近序列 為具有甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和亮氨酸組成的保守區(qū)（氨基酸位置為27至30)，29位絲 氨酸與178位天冬氨酸和181位組氨酸共同構(gòu)成酯酶催化中心，說明ElO屬于酯酶第II家 族。綜上所述，ElO應(yīng)為酯酶家族中的一名新成員。
[0007] 在不影響酯酶ElO蛋白活性前提下，可對(duì)SEQ ID N0:2所示的遠(yuǎn)離催化中心氨基 酸位置（優(yōu)選遠(yuǎn)離27-30、178-181氨基酸位置）的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或 缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有酯酶ElO活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的公知常 識(shí)，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來說，只有發(fā)生在功能結(jié)構(gòu)域 的位點(diǎn)突變可能對(duì)蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而對(duì)于發(fā) 生在遠(yuǎn)離功能結(jié)構(gòu)域（優(yōu)選27-30、178和181氨基酸位置）的氨基酸位點(diǎn)，由于這一區(qū)域 不參與蛋白功能構(gòu)象，因而氨基酸的個(gè)別點(diǎn)突變不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影 響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。優(yōu)選的酯酶ElO突變體具有至少與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以上的同源性，最優(yōu)選具 有至少99%以上的同源性。
[0008] 同理，本發(fā)明還提供了編碼如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的基因序列，其與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列一致；本發(fā)明還提供對(duì)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中除 79-90、532-543位核苷酸外的其他核苷酸進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸從 而獲得編碼能基本保留酯酶ElO蛋白生物學(xué)活性的突變體基因。優(yōu)選的酯酶ElO突變體基 因具有至少與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以 上的同源性，最優(yōu)選具有至少99%以上的同源性。
[0009] 利用基因克隆技術(shù)，可將克隆到的酯酶ElO基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達(dá)制備重組酯酶E10。合適的原核生物宿主包括各種細(xì) 菌如E. coli等，合適的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如中國(guó)倉(cāng) 鼠卵巢細(xì)胞）等，優(yōu)選采用原核表達(dá)系統(tǒng)E. coli。
[0010] 合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種可商業(yè)化購(gòu)買的原核或真核表達(dá)載 體，原核表達(dá)載體如PET系列載體，pQE系列載體；酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A，pHIL-D2， pPIC9，pHIL-Sl (Invitrogen Corp. San Diego. California. USA);動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc. USA)等。一個(gè)優(yōu)選的例子是將本發(fā)明篩 選到的酯酶基因 elO連接到大腸桿菌表達(dá)載體pSMT3上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3) 中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出高活性的重組酯酶。
[0011] 本發(fā)明還提供了酯酶ElO或能表達(dá)酯酶ElO的宿主菌在工業(yè)上的應(yīng)用，例如可用 于催化酯類水解。通過酯酶活力測(cè)定表明，酯酶ElO或上述能表達(dá)ElO酯酶的宿主菌可用 于水解短鏈脂肪酸酯，例如C2-C8短碳鏈脂肪酸酯，同時(shí)對(duì)C10-C16的長(zhǎng)碳鏈脂肪酸酯也具 有一定降解作用。優(yōu)選的短鏈脂肪酸脂為具有C2-C8短碳鏈的對(duì)硝基苯酚酯，例如對(duì)硝基 苯酚乙酸酯、對(duì)硝基苯酚丁酸酯、對(duì)硝基苯酚己酸酯、對(duì)硝基苯酚辛酸酯和對(duì)硝基苯酚癸酸 酯等，其中底物為對(duì)硝基苯酚己酸酯（C6)時(shí)催化活性最高，酶活為29. 4U/mg。
[0012] ElO酯酶催化水解溫度范圍為15~35°C，優(yōu)選為15~20°C ;所述水解的pH值為 4. 0~9. 0,優(yōu)選為7. 0~7. 5。在lmol/L NaCl中仍能保持80%以上活性；在添加 EDTA、 Ba2+、Ca2+、C02+、Mg2+和S r2+條件下，對(duì)酶活影響不大；在添加有機(jī)溶劑二甲基亞砜、甘油和異 丙醇條件下，酶學(xué)活性增大。
[0013] 本發(fā)明從深海沉積物來源細(xì)菌Croceicoccus marinus E4A9T中篩選獲得新的低 溫耐鹽酯酶基因，發(fā)現(xiàn)了該基因編碼蛋白具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于催化解酯和酶法 合成酯產(chǎn)品生產(chǎn)過程中。獲得的酯酶基因可克隆到合適的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)工業(yè) 化生產(chǎn)低溫耐鹽酯酶，為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供成本低廉的低溫耐鹽酯酶起始材料。該酶的 生產(chǎn)可在食品加工、洗滌劑和廢水處理等低溫或含鹽生產(chǎn)工藝中顯示出重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì) 價(jià)值。
【附圖說明】
[0014] 圖1為純化酯酶ElO的聚乙酰胺凝膠電泳分析圖。
[0015] 圖2為酯酶ElO的底物特異性圖。C2 :對(duì)硝基苯酚乙酸酯；C4 :對(duì)硝基苯酚丁酸酯、 C6 :對(duì)硝基苯酚己酸酯；C8 :對(duì)硝基苯酚辛酸酯；ClO :對(duì)硝基苯酚癸酸酯；C12 :對(duì)硝基苯酚 十二酸酯；C14 :對(duì)硝基苯酸十四酸酯；C16 :對(duì)硝基苯酸十六酸酯；定義底物為C6時(shí)測(cè)定值 為 100%〇
[0016] 圖3為酯酶ElO最適反應(yīng)溫度圖。
[0017] 圖4為酯酶ElO最適反應(yīng)pH圖。
[0018] 圖5為二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)酯酶ElO活性影響圖。
[0019] 圖6為有機(jī)溶劑和去垢劑對(duì)酯酶ElO活性影響圖。
[0020] 圖7為NaCl對(duì)酯酶ElO活性影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1酯酶基因 e 10的獲取
[0022] 基于深海沉積物來源細(xì)菌Croceicoccus marinus E4A9T*基因組、開放閱讀框 預(yù)測(cè)及基因注釋結(jié)果，篩選脂類水解酶相關(guān)基因。通過Blastx(http://blast. ncbi. nlm. nih.gov/)比對(duì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知酯酶基因序列的同源性。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析獲得 elO 基因，大小為 618bp，堿基組成為 106Α(17· 15% )、97T(15.70% )、203C(32.85% )和 212G(34. 30%)，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。編碼蛋白大小為205個(gè)氨基酸殘基， 其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，與之相似性 最高的是同屬細(xì)菌Croceicoccus naphthovorans中的酯酶，相似性為64%，其在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)為WP_047820200。
[0023] 氨基酸序列分析結(jié)果顯示，酯酶ElO活性位點(diǎn)絲氨酸附近序列為具有甘氨酸、天 冬氨酸、絲氨酸和亮氨酸組成的保守區(qū)（氨基酸位置為27至30)，29位絲氨酸與178位天 冬氨酸和181位組氨酸共同構(gòu)成酯酶催化中心，說明ElO屬于酯酶第II家族。綜上所述， ElO應(yīng)為酯酶家族中的一名新成員。
[0024] 綜上所述，ElO應(yīng)為酯酶家族中的一名新成員。
[0025] 實(shí)施例2酯酶基因 elO的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的