人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及一類一類人羧酸酯酶l(hCEl)的生物發(fā)光 探針底物及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 作為臟器和組織的特征標志物，hCEl在人群的肝臟中含量很高，其蛋白表達量在 肝臟分布蛋白中排前十位。hCEl是一種膜結合蛋白，定位于細胞內質網中【CANCER RESEARCH 1998; 58:3627-32&Drug Metab ? Pharmacokinet ? 2006; 21:173-85】，同時也會分 泌到細胞外進入血液循環(huán)系統(tǒng)【Proteomics 2009;9:3989-99】ACE1的基本代謝反應是催 化含較小醇基和較大酰胺基底物的水解。雖然，在多種組織的中都檢測到hCEl的蛋白表達， 但其在人肝臟組織含量遠高于其它組織。hCEl參與多種外源性物質的代謝清除，例如藥物 奧司他韋、哌醋甲酯等。同時，hCEl在維持人體正常生理功能功能發(fā)揮不可忽視的作用，參 與人體內膽固醇酯和游離脂肪酸的運輸和代謝過程，維持脂質代謝平衡【Chemi Stry& Biology，Vol. 10，341-349，April ,2003】。在正常健康人體中，hCEl除了以較高的含量分布 在肝組織的細胞中，也有少量hCEl在血漿中被檢測到，更重要的是，肝細胞肝癌患者血漿中 的hCEl是健康人群的2-5倍，因此hCEl被認為是肝細胞肝癌早期診斷的一種良好的潛在血 清學標志物【Proteomics 2009，9,3989-3999】。此外，肝細胞破損相關的肝臟疾病患者也會 有hCE 1釋放入血，引起血漿中hCE 1濃度發(fā)生變化，因此，血漿中hCE 1可作為肝臟急性損傷的 標志物。hCEl的分布存在很大的個體差異，hCEl酶的表達和功能本身會受到人體遺傳、年 齡、疾病、性別、環(huán)境和共服藥物等多種因素的影響。因此，hCEl酶的活性檢測方法具有廣闊 的臨床應用前景，可用于評價人體肝臟功能異常、藥物及毒物導致的肝毒性、肝細胞癌早 期診斷、肝功能個體化評估、以及部分前體藥物的個性化使用等。此外，hCEl作為維持人體 脂質代謝平衡的重要蛋白，其抑制劑可作為降血脂藥物使用，hCEl也被FDA批準為重要的藥 物作用靶點。hCEl活性的快速表征方法也可用于新藥研發(fā)早期發(fā)現(xiàn)及評估hCEl新型高效抑 制劑。因此，開發(fā)尚效、超靈敏、尚特異性的hCEl活性檢測方法對于臨床樣本中hCEl活性的 檢測，以及新藥高內涵高通量篩選至關重要。
[0003] 本發(fā)明提供了（S)-4,5_二氫_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸酯衍生物（簡稱 DBT-R)及其作為hCEl探針底物的應用，其經hCEl水解后可生成熒光素酶的底物(S)-4,5-二 氫-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸化合物(簡稱DBTC)，利用DBTC與熒光素酶反應產生生 物發(fā)光進行檢測。該酶促反應具有選擇性高、代謝產物易檢測、酶活性及抑制劑活性評價快 速省時的特點。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供人羧酸酯酶l(hCEl)的特異性生物發(fā)光探針反應及其定量 檢測方法和應用，該類特異性探針的水解產物是熒光素酶的底物，易于檢測。利用該探針反 應可對多種生物體系中的hCEl的分布和功能進行定量評價。
[0005] -類人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物，該探針底物DBT-R可被hCEl特異性催化發(fā) 生酯鍵水解反應并生成相應的羧酸產物DBTC，該探針底物如圖1，水解產物的結構如下：
[0007] 其中，R1 選自-NH2、-N(CH3) 2、-N(CH2CH3) 2、_N( CH2CH2CH3) 2、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3; R2選自 H、C1-C3烷基、C1-C3 亞烷基氨基；R3選 自Cl-ClQ烷基、-(Cl_C8亞烷基）-氛基、-(Cl_C8亞烷基）-氛基、-(Cl_C8亞烷基）-硝基、-(Cl_C3 亞烷基)-0-(Ci-Cs烷基）、環(huán)烷基、-(&-C3亞烷基)-環(huán)烷基、芳基、-(&-C3亞烷基)-芳基、雜 芳基、-(&-C3亞烷基)-雜芳基、雜環(huán)基或-(&-C3亞烷基)-雜環(huán)基。
[0008] 所述DBTC是熒光素酶的底物，可采用生物發(fā)光檢測器實現(xiàn)產物的快速靈敏檢測， 所述生物發(fā)光檢測器為發(fā)光分析儀、酶標儀、顯微鏡或小動物成像儀。
[0009] 本發(fā)明還提供了一類人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的制備方法，其特征在于：
[0010] 將2-氰基苯并噻唑（1 .Oeq)和D-半胱氨酸（1 ? H .5eq)加入到甲醇/水的混合溶液 中，加入碳酸鉀（1.1-1.5eq)，20-30°C攪拌反應1-3小時，生成(S)_4，5-二氫_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸化合物（簡稱DBTC)。所得產物DBCT(1. Oeq)在4-N，N-二甲基吡啶(0.1 -0.5eq)和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亞胺（1.1_1.5叫）的存在下與醇(1101?3)縮合反應， 20-30°C攪拌反應6-24小時生成（S)-4,5-二氫_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物 (簡稱DBT-R)。
[0011]合成路線如下：
[0013]本發(fā)明還提供人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的應用，該類底物可被hCEl特異 性識別并催化發(fā)生水解反應，通過定量檢測單位時間內水解產物的生成量即可測定不同生 物來源(組織、細胞、血漿)中的hCEl活性;具體測定方法為：
[0014] (1)預孵育:將待測樣品在緩沖體系中，20~60度下孵育3~5分鐘；
[0015] (2)起始反應:加入式（1)化合物混勻，20~60度下孵育2~120分鐘；
[0016] (3)檢測：加入熒光素酶檢測試劑，混勻，37°C孵育20-30min;用酶標儀或化學發(fā)光 分析儀測定樣品，檢測波長620nm〇
[0017] ⑷測定單位時間內水解產物生成量作為hCEl活性的評價標準。
[0018] 本發(fā)明提供的一類人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的的應用，所述水解反應體 系為PBS緩沖液，探針底物的濃度介于1/10~10K m之間，孵育體系pH介于5.5-10.5之間，反 應溫度介于20_60°C之間，底物消除率或水解產物的生成率介于0.1 %~20%之間。
[0019] 所述不同生物來源為重組表達的hCEl、人或動物的細胞制備物、組織制備液、血漿 等常見生物樣本。
[0020] -種人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的應用，該探針用于人羧酸酯酶1抑制劑的 快速篩選與評估，方法為:按照探針的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單 位時間內水解產物的生成量評估該生物體系中hCEl的殘余活性，進而實現(xiàn)hCEl抑制劑的快 速篩選及抑制能力的定量評價。
[0021] 本發(fā)明提供的一類人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的應用，探針水解產物均為 熒光素酶的底物，可采用生物發(fā)光檢測器實現(xiàn)底物的快速靈敏檢測。
[0022] 本發(fā)明提供的人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的應用，該特異性探針底物及相 應hCEl活性檢測過程不會受到生物體系基質及雜質的干擾，可用于重組表達的hCEl、人或 動物的細胞制備物、組織制備液、血漿等各種生物體系中hCEl酶活性的定量檢測。
[0023] 本發(fā)明提供了人羧酸酯酶1的生物發(fā)光探針底物的的應用，該特異性探針底物用 于重組表達的hCEl、人或動物的細胞制備物、組織制備液、血漿等常見生物樣本中酶活性 的定量測定，以及利用該探針反應快速篩選hCEl酶的抑制劑。
[0024] 本發(fā)明涉及的hCEl特異性探針反應具有如下優(yōu)點：
[0025] 1.廉價易得：（S)-4,5_二氫_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(簡稱DBT-R)可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行。
[0026] 2 ?高特異性：（S)-4，5-二氫_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(簡稱DBT- R)可被hCEl特異性代謝成一個代謝產物，即酯鍵斷裂的水解產物，人體其余水解酶均不參 與該反應。
[0027] 3.高靈敏度:DBT-R可被hCEl快速水解釋放出（S)-4,5-二氫_2_(苯并噻唑-2-基） 噻唑-4-甲酸衍生物(簡稱DBTC)，且產物為熒光素酶的底物，可利用生物發(fā)光檢測器實現(xiàn)超 靈敏檢測，其對目標物的檢測下限可達納摩爾級。
[0028] 4.易高通量檢測：可在實驗室常見各類熒光酶標儀及臨床大生化儀上測定，可利 用96或386微孔板進行批量檢測。
【附圖說明】
[0029] 圖l.(S)-4,5-二氫_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸酯衍生物(簡稱DBT-R)結構 通式；
[0030] 圖2.(S)-4,5-二氫-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯合成路線；
[0031] 圖3. (S)-4,5-二氫-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸甲酯1H-匪R譜 圖；
[0032] 圖4.(S)-4,5-二氫-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯的選擇性；
[0033] 圖5.hCEl的定量標準曲線；
[0034] 圖6.hCEl的活性化學抑制實驗
[0035] 圖7.不同組織微粒體中hCEl的活性定量評估
【具體實施方式】
[0036] 下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。（S)_4， 5-二氫-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(簡稱DBT-R)結構通式如圖1所示。
[0037] 實施例l.(S)-4,5_二氫-2-(6_二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯的合成
[0038]合成路線如圖2所示。
[0039] (1)化合物2的合成
[0040] 室溫，將化合物1 (18.2g，107.3mmol，1. Oeq)加入濃硫酸溶液中（90mL)，攪拌溶解。 將反應體系冷卻到〇_5°C，將硝酸鉀（11.9g，118.0mmol，1. leq)分批10次加入到上述反應體 系中。加完室溫反應，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應進程。反應完畢后將反應體系傾入冰水中 (250mL)，抽濾得粗產物經乙酸乙酯重結晶得黃色固體，產率80-90%，ESI-MS m/z 215.0[M +H] +
[00411 (2)化合物3的合成
[0042] 室溫，將化合物2(6.0g，27.95mmol，1 .Oeq)和二氯化錫一水合物（18.9g， 83.85臟〇1，3.0叫)加入乙醇溶液中（80111〇，將體系升溫回流反應，薄板層析(11〇監(jiān)測反應 進程。反應完畢后，蒸除溶劑，加水（20mL)，1N NaOH調pH = 7-8，過濾，濾液乙酸乙酯萃取 (50mLX3)，合并有機相飽和氯化鈉溶液洗(20mLXl)、無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑，粗產物 柱層析(石油醚/乙酸乙酯=3/1)得化合物3，黃色固體，產率40-50%351-1^111/2 185.0[1 +H].。
[0043] (3)化合物4的合成
[0044]室溫，將化合物3(92 ? 3mg，0 ? 5mmol，1 .Oeq)和氰化鈉（49. Omg, lmmol，2eq)加入二 甲基亞砜(5mL)中，加熱130°C反應，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應進程。反應完畢后，冷卻到室 溫，加