用于培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的含有特異氨基酸的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別的，屬于采用培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑節(jié)草、云南鐵皮，是蘭科(Orchidaceae)多年生 附生草本植物，是一種珍貴的中藥材。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，具有滋陰清熱、生津 益胃、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身、鎮(zhèn)痛消炎的功效。同時(shí)現(xiàn)代研究表明，石斛藥材除具有本草記載 的等功效外，還具有抗腫瘤、抗輻射、抗血小板凝集及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效。近年來(lái)石斛 藥材的需求量不斷增加，而栽培技術(shù)的不斷創(chuàng)新使得人工種植石斛的面積不斷增大，然而 隨著集中種植面積的增加，出現(xiàn)的問(wèn)題也不斷增多，石斛種植出現(xiàn)多種不同的病害，例如鐵 皮石斛褐斑病。石斛葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點(diǎn)，后小點(diǎn)漸漸擴(kuò)大為約5~ 6mm的病斑。這不僅影響石斛的品質(zhì)，也影響石斛的產(chǎn)量，具統(tǒng)計(jì)褐斑病導(dǎo)致產(chǎn)量損失5 % -10%。防止褐斑病的發(fā)生和擴(kuò)增有助于提高石斛生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)，確保石斛產(chǎn)業(yè)健康有 序的發(fā)展。為了研究如何防治鐵皮石斛的褐斑病，就需要首先培養(yǎng)褐斑病來(lái)進(jìn)行一些方面 的研究，例如研究該病菌的生物學(xué)特性，藥效試驗(yàn)等篩選出合適的藥物進(jìn)行防治。但是，這 種病菌難以培養(yǎng)，而且產(chǎn)量低，為此，需要提供如何高效率的培養(yǎng)褐斑病病菌進(jìn)行相關(guān)方面 的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括： 提供草莓煎汁培養(yǎng)基，其中該草莓煎汁培養(yǎng)基的組成為:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g， 添加水至l〇〇〇ml。
[0004] 優(yōu)選的，草莓莖葉200g經(jīng)過(guò)如下過(guò)程進(jìn)行制備：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和 200g草莓莖葉，煮沸5min后，過(guò)濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0005] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7.
[0006] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0007] 優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多P彖莖點(diǎn)霉（Phomamultirostrata (Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供草莓煎汁培養(yǎng)基在制作培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌培養(yǎng)基中的 用途，其中所述的草莓煎汁培養(yǎng)基由下列組分組成:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g。
[0009] 優(yōu)選的，優(yōu)選的，草莓莖葉200g經(jīng)過(guò)如下過(guò)程進(jìn)行制備:在煎鍋中放入1000mL蒸餾 水和200g草莓莖葉，煮沸5min，過(guò)濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0010] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7。
[0011]優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0012]優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點(diǎn)霉（Phomamultirostrata (Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)〇
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括提供一種 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)的組成如下：氮源化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯 化鉀0.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質(zhì)30g，瓊脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物質(zhì) 為麥芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0014]優(yōu)選的，糖源物質(zhì)為纖維乙糖。
[0015]優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L(zhǎng)-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸 鉀。
[0016]優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L(zhǎng)-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0017] -種培養(yǎng)基在用于制備培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌培養(yǎng)基中的用途，其中，所述的培 養(yǎng)基的組成如下:氮源(氨基酸)化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯化 鉀〇.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質(zhì)30g，瓊脂20g，其中所述的糖源物質(zhì)為麥芽糖、蔗糖、菊 糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0018]優(yōu)選的，糖源物質(zhì)為纖維乙糖。
[0019]優(yōu)選的，所述的氨基酸化合物為L(zhǎng)-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。
[0020]優(yōu)選的，所述的氨基酸化合物為L(zhǎng)-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0021]優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點(diǎn)霉（Phomamultirostrata(Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0022] 有效效果
[0023]通過(guò)本發(fā)明的特異培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，可以獲得優(yōu)質(zhì)、大量的褐斑病菌，為研究褐 斑病菌提供了有益的材料，特別是可以提供大量的孢子。
[0024]具體實(shí)施例子
[0025] 1材料與方法
[0026] 1.1鐵皮石斛褐斑病病樣采集及病原菌的分離
[0027]田間鐵皮石斛褐斑病病樣采集于浙江省樂(lè)清縣雁蕩山鎮(zhèn)的樂(lè)清鐵楓堂鐵皮石斛 基地、樂(lè)清同豐鐵皮石斛基地、樂(lè)清靈巖鐵皮石斛基地;采樣后將標(biāo)樣放入保鮮袋帶回實(shí)驗(yàn) 室置于5°C冰箱，待用。切取鐵皮石斛褐斑病鏡檢并用PSA培養(yǎng)基分別于進(jìn)行常規(guī)組織分離 和劃線(xiàn)分離。
[0028] 1.2致病性測(cè)定
[0029]分別采用分離自鐵皮石斛褐斑病病樣分離物的菌絲和分生孢子液(稀釋成IX106 個(gè)/mL)，對(duì)石斛進(jìn)行嫩枝活體傷口和無(wú)傷接種，在25°C的XT5401-CD275TJH智能生物人工氣 候箱內(nèi)，RH98%以上，12小時(shí)光照12小時(shí)黑暗接種后培養(yǎng)，以健康的枝條為對(duì)照，重復(fù)3次， 每天定時(shí)觀(guān)察記錄發(fā)病情況，分析致病性。
[0030] 1.3病原菌的培養(yǎng)性狀
[0031] 病原菌接種于PSA上于25°C培養(yǎng)7d，記錄菌落形態(tài)，顏色;測(cè)量100個(gè)分生孢子的大 小，
[0032]重復(fù)3次，記錄平均值。
[0033] 1.3.1不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛褐斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子產(chǎn)生的影響。
[0034]病原菌于25°C用下表中的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次，5d后測(cè)量菌落直徑，菌絲 干重、分生孢子器的產(chǎn)生情況、及其菌落色澤等。
[0035] 表1:不同培養(yǎng)基的配方
[0036]
[0037] *煎汁培養(yǎng)基的準(zhǔn)備過(guò)程：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和200g相應(yīng)的物品，煮沸 5min后，過(guò)濾留濾液，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0038] 1.3.2，針對(duì)最優(yōu)選的培養(yǎng)基(草莓煎汁培養(yǎng)基），我們確定不同pH值對(duì)鐵皮石斛褐 斑病菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子的影響將直徑4.0mm的菌絲塊移于pH值4-12的不同pH值的草莓 煎汁培養(yǎng)基上(pH值采用pHS-9V酸度計(jì)測(cè)量配制），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次，6d后測(cè) 量菌落干重，計(jì)算分生孢子數(shù)量。
[0039] 1.3.3不同溫度對(duì)鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子的影響將直徑4.0mm的 菌絲塊移于草莓煎汁培養(yǎng)基平板上，置于5°C，10°C，15°C，20°C，25°C，30°C，35°C不同溫度 下培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次，6d后測(cè)量菌落直徑和分生孢子數(shù)量。
[0040] 1.3.4不同碳源對(duì)鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子的影響。
[0041]經(jīng)過(guò)我們的大量研究，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以草莓煎汁培養(yǎng)基來(lái)研究最佳碳源和氮源對(duì)該病 菌培養(yǎng)的影響的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)不同的碳源對(duì)培養(yǎng)的性狀(菌落干重和產(chǎn)孢情況)并沒(méi)有實(shí)質(zhì)的 差異，也就是說(shuō)不同的碳源或氮源似乎起到同樣的作用，沒(méi)有實(shí)質(zhì)的改善和影響，同樣，在 其他類(lèi)似的培養(yǎng)基上，例如樹(shù)皮煎汁培養(yǎng)基，甘蔗煎汁培養(yǎng)基，荷葉煎汁培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng) 基(0MA培養(yǎng)基)獲得與草莓煎汁培養(yǎng)基類(lèi)似的結(jié)果(具體數(shù)據(jù)略）。
[0042]相反，查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再分別用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳 糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纖維素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳 糖、麥芽糖、纖維素鈉、纖維乙糖等20種不同碳源等量置換蔗糖(含量與蔗糖一樣），于25°C 下培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次，6d后測(cè)量菌落直徑，觀(guān)察菌落干重和產(chǎn)孢情況，獲得了不同的結(jié) 果，具體見(jiàn)結(jié)果分析。
[0043] 1.3.5不同氮源對(duì)鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子的影響。
[0044]以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用谷氨酸、谷氨酰氨、天門(mén)冬酰氨、天門(mén)冬氨酸、 甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪 蛋白水解物、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉等26種氮源等量置換硝酸鉀或硝酸鈉(質(zhì)量與 硝酸鉀一樣），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次，6d后測(cè)量菌落直徑，觀(guān)察菌落干重和產(chǎn)孢情 況。
[0045] 2.0結(jié)果與分析
[0046] 2.1鐵皮石斛褐斑病的癥狀
[0047]褐斑病僅侵染鐵皮石斛的葉片。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點(diǎn)，后 小點(diǎn)漸漸擴(kuò)大，最大病斑約5~6mm。病斑圓形或橢圓形，淡褐色至黑褐色，有時(shí)病健交界處 常有一圈褐色的暈圈。病斑中間凹陷。嚴(yán)重時(shí)，葉片上出現(xiàn)許多大小不一的病斑，一般新葉 不染病。
[0048] 2.2病原菌的分離和致病性測(cè)定
[0049]對(duì)幾十個(gè)石斛褐斑病標(biāo)樣進(jìn)行劃線(xiàn)分離和常規(guī)組織分離，5d后，培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出少 量細(xì)菌和不同的真菌，將這些細(xì)菌和真菌置于適宜的溫濕度條件下對(duì)在相同鐵皮石斛健康 的枝葉進(jìn)行柯赫法則檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌大都為芽孢桿菌，均為非致病菌;其中重復(fù)分離到 的一種真菌分離物為疑似病原物。將這種真菌分離物置于適宜的溫濕度條件下在相同鐵皮 石斛健康的枝葉進(jìn)行接種檢驗(yàn)，這些真菌分離物均對(duì)石斛葉致病，發(fā)病病癥與田間基本一 致，通過(guò)分子生物方法鑒定為即為石斛褐斑病病原菌。
[0050] 2.3病原菌分離物的形態(tài)及培養(yǎng)性狀
[0051]病原菌在PSA上，菌絲成放射狀生長(zhǎng)，氣生菌絲灰白色，短絨毛狀，較發(fā)達(dá)。平鋪于 培養(yǎng)基上，初期菌落(尤其在其邊緣)為淡淡的粉紅色，隨即轉(zhuǎn)為灰色，再由灰色轉(zhuǎn)為褐色， 最后由褐色轉(zhuǎn)為黑褐色，菌落也