一種來源于海洋生物的細(xì)菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生產(chǎn)瓊膠酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]生物技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]瓊膠是一種從江蘺、石花菜、紫菜等紅藻類{RhodophyceaS)海藻細(xì)胞壁中提取出來的具有高凝膠強(qiáng)度的細(xì)胞間多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠組成。瓊脂糖是由α-D-半乳糖和3，6-內(nèi)醚-a -L-半乳糖以a -1，3和β -1，4糖苷鍵交替連接形成的線性大分子；硫瓊膠由半乳糖殘基組成糖鏈，并交聯(lián)了硫酸基、甲基、丙酮酸等取代基。瓊膠酶可催化水解瓊脂糖分子內(nèi)的糖苷鍵，基于所催化糖苷鍵的類型差異，可以把瓊膠酶分為2種:一種是a-瓊膠酶(E.C.3.2.1.158)，作用于瓊脂糖的a (1 — 3)糖苷鍵，產(chǎn)物為以3，6_內(nèi)醚-a -L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖(Agaro-oligosaccharide)系列，包括瓊二糖、瓊四糖等系列寡糖；另一種是瓊膠酶(E.C.3.2.1.81)，作用于瓊脂糖的β (1 —4)糖苷鍵，產(chǎn)物為以D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖(Neoagaro-oligosaccharide)系列，包括新瓊二糖、新瓊四糖等系列寡糖。研究表明，瓊膠酶的作用機(jī)理大體可分為三種:第一種，由內(nèi)切β瓊膠酶裂解瓊膠的β糖苷鍵，形成新瓊四糖，進(jìn)而被外切β瓊膠酶降解為新瓊二糖，最后新瓊二糖酶將其分解為半乳糖和3，6-內(nèi)醚€1半乳糖。第二種，胞外的α瓊膠酶作用于α-1，3-糖苷鍵，形成非還原性末端為D-半乳糖殘基的瓊二糖系列寡糖。第三種，瓊膠酶的蛋白體結(jié)合兩條寡糖鏈，一條寡糖鏈上的四個(gè)糖單體結(jié)合在蛋白體的活性部位；另一條寡糖鏈有八個(gè)糖單體與蛋白體相連處在與催化活性部位相對(duì)應(yīng)平行的部位上。微生物來源的瓊膠酶產(chǎn)生菌主要是海洋細(xì)菌，包括假單孢菌屬{Pseudomonassp.)、交替單抱菌屬)、假交替單胞菌屬{Pseudoal teromonas sp.)、弧菌屬(Vibr1 sp.)、■瓊膠菌屬(Agarivoranssp.)、類芽抱桿菌屬{Paenibacillus sp.)、口蜜細(xì)胞菌屬)、芽孢桿菌屬{Bacillus sp.)、產(chǎn)微球莖菌屬{Microbulbifersp.)、桃色桿菌屬{Persicobacter^.)、鹽桿菌屬{Salegentibacter sp.)、不動(dòng)桿菌屬
)、寡養(yǎng)單胞菌屬{Stenotrophomonas sp.)等。是重要的產(chǎn)生瓊膠酶的菌屬，產(chǎn)生的瓊膠酶也有多種酶，酶的分子量是瓊膠酶重要的性質(zhì)表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶學(xué)性質(zhì)的重要指標(biāo)。王靜雪報(bào)道sp.瓊膠酶分子量39.5kDa,劉美英報(bào)道Ac tinobaci 1 lusgerms瓊膠酶分子量85kDa，唐中秀報(bào)? P冊(cè)nibacillus sp.瓊膠酶分子量30kDa，馬怡茗等研究sp.瓊膠酶分子量50.4kDa，李京寶報(bào)道Pseudoal teromonas sp.瓊膠酶分子量51kDa，吳倩倩報(bào)道Pseudoalteromonas sp.瓊膠酶分子量50.8kDa等等。本案發(fā)明人從采自海洋動(dòng)物銹凹螺樣品中篩選出一株高產(chǎn)瓊膠酶菌株，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和16Sr DNA序列分析，初步鑒定其屬于假交替單胞菌屬{Pseucbalteromona^)，命名為Pseucbalteromonassv.QJ97。通過酶的分離純化，SDS-PAGE確定了該菌株產(chǎn)生的瓊膠酶的分子量為35 kDa。經(jīng)查閱資料、檢索文獻(xiàn)可知，該瓊膠酶的分子量不同于以往的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的分離純化出一種來源于海洋生物的菌株P(guān)seudoeil teromonas.sp.QJ97，其具有產(chǎn)瓊膠酶的特性，并對(duì)其產(chǎn)酶特性和分泌的酶蛋白進(jìn)行分離純化。保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:湖北、武漢、武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC Μ2014567，保藏日期:2014年11月16日。本發(fā)明的目的是提供一種來源于海洋生物的微生物菌株P(guān)seudoalteromonas.sp.QJ97，并利用該菌株制備瓊膠酶。
[0004]本發(fā)明的特點(diǎn)如下:
將采集的海洋生物內(nèi)臟以無(wú)菌操作方法取出放入無(wú)菌生理鹽水中震蕩、洗滌，將洗滌到的溶液通過涂布、初篩、復(fù)篩獲得了瓊膠酶高產(chǎn)菌株QJ97。該菌株的菌落呈規(guī)則的圓形，表面濕潤(rùn)，乳白色，邊緣整齊，不易挑起。此菌株在2216E培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)24 h形成單菌落，菌落周圍形成較大的透明水解圈，菌落直徑1.8-2.2 mm，透明圈內(nèi)圈直徑7.0 mm，夕卜圈直徑11.5 mm。通過革蘭氏染色初步斷定其為革蘭氏陰性菌。提取了菌株QJ97的基因組DNA，以細(xì)菌16S rRNA作為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rDNA的測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果與Genebank中假交替單胞菌屬的序列同源性最高，相似度達(dá)到99%。結(jié)合菌株QJ97的形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定其屬于假交替單胞菌屬{Pseudoalteromonas、，并命名為Pseudoalteromonassp.QJ97。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中生物量達(dá)到最大，進(jìn)入穩(wěn)定期，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，發(fā)酵液中生物量開始下降，瓊膠酶的酶活力反而達(dá)到最高值625.93 U/ml，在之后的84 h內(nèi)酶活力未見降低，說明該菌株發(fā)酵產(chǎn)生的瓊膠酶穩(wěn)定性好。作為瓊膠酶的生產(chǎn)菌株，本發(fā)明的菌株產(chǎn)酶具有營(yíng)養(yǎng)要求低、易培養(yǎng)和培養(yǎng)周期短的特點(diǎn)。用本發(fā)明的菌株作為瓊膠酶生產(chǎn)菌，具有產(chǎn)品穩(wěn)定性好、活性高、生產(chǎn)周期短、成本低的特點(diǎn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G_75凝膠過濾層析對(duì)菌株QJ97進(jìn)行了分離純化，經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，最終收集到的活力組分呈現(xiàn)單一條帶，該瓊膠酶的相對(duì)分子質(zhì)量為35 kDa(圖1)。其分子量不同于已報(bào)導(dǎo)的任何瓊膠酶的分子量。
【附圖說明】
[0005]圖1 Pseudoalteromonas.sp.QJ97產(chǎn)的瓊膠酶SDS-PAGE電泳結(jié)果。左邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，右邊為菌株P(guān)seudoalteromonas鄧.QJ97發(fā)酵并經(jīng)純化后的電泳純度的瓊膠酶蛋白條帶，表示數(shù)量單位為:kDa。
【具體實(shí)施方式】
[0006]1.菌株的分離純化:
本發(fā)明Pseudoaltenmonassp.QJ97菌株的獲得:將采集的海洋生物內(nèi)臟以無(wú)菌操作方法取出放入裝有25 mL無(wú)菌生理鹽水的100 mL三角瓶中，搖勻，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)在2216E初篩培平板養(yǎng)基上劃線進(jìn)行純化，28 °(:倒置培養(yǎng)48 h。選擇周圍出現(xiàn)透明圈和凹陷的菌落，在初篩培養(yǎng)基平板上劃線獲得純培養(yǎng)。將初篩得到的菌株接種至裝有50 mL復(fù)篩培養(yǎng)基(2216E基礎(chǔ)添加CaCl2 0.1 g, NaCl 15 g, NH4C1 1 g,瓊脂2 g,蒸餾水1000mL, pH 7.2-7.6)的100 mL三角瓶中，28 °C，160 rpm培養(yǎng)24 h后，取發(fā)酵液測(cè)定瓊膠酶活力。挑選出發(fā)酵液酶活力最高的菌株，即得到一株能產(chǎn)瓊膠酶的細(xì)菌。
[0007]2.菌株的鑒定:
將分離得到是菌株經(jīng)過16S r DNA基因序列測(cè)序結(jié)果:
CGAATGGCGCGGACTACCATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCG
GACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAG