一種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及其轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及其 轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌經(jīng)過處理后可以攝取外源DNA(PlasmidDNA，PhageDNA等），處于這種 狀態(tài)的細(xì)胞稱為"感受態(tài)細(xì)胞"（CompetentCell)。將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之獲 得新的遺傳性狀的過程稱為"轉(zhuǎn)化"。在微生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等研究領(lǐng)域，經(jīng)常 要使用各種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)化操作。
[0003] 感受態(tài)細(xì)胞的制備是分子生物學(xué)研究中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其質(zhì)量的好壞直接影響 到后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的進(jìn)行。常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2法、Hanahan和Inoue法。 CaCl2法（CohenSN,ChangACY,HsuL.Nonchromosomalantibioticresistancein bacteria:genetictransformationofEscherichiacollbyR-factorDNA.Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1972，69: 2110-2114.)是目前實(shí)驗(yàn)室制備感受態(tài)細(xì)胞的常規(guī)方 法，該方法簡(jiǎn)便易行，但制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較低，只能滿足常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需 求；Hanahan法（HanahanD.StudiesontransformationofEscherichiacollwith plasmid.J.Mol.Biol. 1983，166: 557-580.)對(duì)操作人員的技巧、細(xì)心程度和試劑純度 要求較高，可重復(fù)性低；Inoue法（InoueH·，HNojimaandOkayamaH.Highefficiency transformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene. 1990, 96: 23-28.)雖然 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率較高，但對(duì)細(xì)菌的〇D_值要求比較嚴(yán)格，并且培養(yǎng)溫度是18°C，細(xì) 菌在此溫度下生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)(約20~50h)，過程相對(duì)繁瑣。
[0004] 目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化過程十分繁瑣，制備過程需要多次離心收集細(xì)胞、 重懸細(xì)胞；轉(zhuǎn)化過程中，熱激反應(yīng)前需要長(zhǎng)時(shí)間冰浴，熱激反應(yīng)后需要加入培養(yǎng)基進(jìn)行長(zhǎng)時(shí) 間培養(yǎng)復(fù)蘇，大大降低了實(shí)驗(yàn)效率。此外，利用常規(guī)方法制備的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率較低， 不能滿足特殊的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求(如DNA文庫(kù)構(gòu)建、大片段DNA的轉(zhuǎn)化)。因此，研究一種 轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)單快速、可重復(fù)性高的方法用于感受態(tài)細(xì)胞的制備和DNA轉(zhuǎn)化，對(duì)分子 生物學(xué)的研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，簡(jiǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化步驟，提高大腸桿菌 的DNA轉(zhuǎn)化效率，提供一種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及其轉(zhuǎn)化方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： a)挑取新活化的大腸桿菌單菌落至2mlLB液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過 夜； b)取50〇μ1過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到50mlS0B液體培養(yǎng)基中，30 °C，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。 值為0. 4~0. 6 ; c)將菌液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，加入5ml預(yù)冷的緩沖液I，混勻，冰浴lOmin; d) 于4°C以4000rpm離心5min收集細(xì)菌； e) 用2ml預(yù)冷的緩沖液II重懸細(xì)菌，冰浴lOmin后，10〇μ1/管分裝，-80°C保存，即得 到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[0007] -種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟： 1) 取一管上述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化后加入相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA，混勻； 2)于42°C熱擊90~120sec; 3)將菌液涂布于抗性平板上，37°C培養(yǎng)12~16h后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。
[0008] 上述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述緩沖液I為包含以下成 分的水溶液：〇. 5~1. 5M氯化鈣，0. 1~0. 5M氯化錳，0. 1~0. 5M甘氨酸，0. 1~0. 5% (v/v)去垢 劑，pH值為4. 0~6. 0 ;其中所述去垢劑由以下試劑中的一種或幾種組成：聚乙二醇辛基苯 基醚（Tritonχ-100)、聚氧乙稀失水山梨醇單月桂酸酯（Tween-20)或乙基苯基聚乙二醇 (NP-40)。
[0009] 所述緩沖液II為包含以下成分的水溶液：50~150mM氯化鈣，10~50mM氯化錳， 10~50mM甘氨酸，0· 5~2mM三磷酸腺苷（ATP)，0. 5~2mM二硫蘇糖醇（DTT)，20~10(^g/ml核酸 沉淀劑，5~15% (v/v)二甲基亞砜（DMS0)，pH值為4. 5~6. 5 ;其中所述核酸沉淀劑由以下試 劑中的一種或幾種組成：糖原（Glycogen)、酵母tRNA或鮭魚精DNA。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是：利用特殊配方的緩沖液制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，簡(jiǎn)化了 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化步驟。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法的感受態(tài)細(xì)胞制備過程只需 離心一次；轉(zhuǎn)化過程操作簡(jiǎn)單、快速，可以省略DNA轉(zhuǎn)化過程的冰浴步驟和轉(zhuǎn)化后大腸桿菌 細(xì)胞的復(fù)蘇步驟，并且具有較高的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明一般可獲得大于lXl〇scfu/^gDNA轉(zhuǎn) 化效率，較佳為大于5X10scfu/^gDNA轉(zhuǎn)化效率，最佳為大于1X109cfu/^gDNA轉(zhuǎn)化效率， 本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化效率比現(xiàn)有方法高5~50倍，不僅能滿足常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，也 能夠滿足構(gòu)建基因文庫(kù)等復(fù)雜實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的要求，是一項(xiàng)較為實(shí)用的新技術(shù)，具有廣 闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0012] 實(shí)施例1:大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化效率測(cè)定 大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的制備步驟如下：挑取新活化的大腸桿菌單菌落至2mlLB液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取50〇μ1過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到50mlSOB液體培養(yǎng) 基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。值為0. 4~0. 6 ;將菌液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，加 入5ml預(yù)冷的緩沖液I，混勾，冰浴lOmin;于4°C以4000rpm離心5min收集細(xì)菌；用2ml預(yù) 冷的緩沖液Π重懸細(xì)菌，冰浴lOmin后，10〇μ1/管分裝，-80°C保存，即得到大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞。
[0013] 上述大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟如下：取一管上述大腸桿菌DH10B感受 態(tài)細(xì)胞，冰上融化后加入?μL濃度為lOpg/μΙ的PUC19DNA，混勻；于42°C熱擊9〇sec ;將菌 液涂布于抗性平板上，37°C培養(yǎng)12~16h后菌落計(jì)數(shù)，重復(fù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算平均轉(zhuǎn)化效 率。
[0014] 本實(shí)施例中，緩沖液I為包含以下成分的水溶液：1M氯化鈣，0. 2M氯化錳，0. 2M甘 氨酸，0.1% (v/v)Tritonχ-100,調(diào)節(jié)pH值為 4.5〇
[0015] 緩沖液II為包含以下成分的水溶液：90mM氯化媽，10mM氯化猛，20mM甘氨酸，ImM ATP，ImMDTT，5〇Pg/mlGlycogen，7% (v/v)DMS0,調(diào)節(jié)pH值為 5. 3。
[0016] 對(duì)比例1 :CaCV法制備大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化效率測(cè)定 CaCV法制備大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下：挑取新活化的大腸桿菌單菌落至 2mlLB