基于dpo引物的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)屎腸球菌的dpo引物、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌株檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)樣品中屎腸球菌或者含有屎腸球菌DNA 的方法以及用于該方法的引物、含有該引物的組合物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 屎腸球菌（EnterococcusFaecium)是一種常見的病原菌。目前屎腸球菌的檢測(cè) 主要依靠傳統(tǒng)生理生化和分子生物學(xué)方法進(jìn)行。傳統(tǒng)生理生化耗時(shí)耗力，不能滿足實(shí)際檢 測(cè)的需要?；谔禺愋砸锏腜CR的方法具備快速、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛用于 轉(zhuǎn)基因、食源性微生物、醫(yī)學(xué)病原菌等方面的檢測(cè)。目前PCR法已經(jīng)被應(yīng)用于屎腸球菌的檢 測(cè)，但普通PCR需要凝膠電泳判斷結(jié)果，耗時(shí)耗力。另外，而不同實(shí)驗(yàn)室之間由于儀器、人 員等差異，可能會(huì)無法精確重復(fù)出試驗(yàn)的各項(xiàng)條件，導(dǎo)致檢測(cè)特異性受到影響，可能照成誤 判。
[0003]SYBRGreenI是一種小分子DNA染料，游離時(shí)不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，但當(dāng)與雙 鏈DNA特異地結(jié)合時(shí)，熒光染料摻入DNA雙鏈，發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，同時(shí)PCR產(chǎn)物的特 異性可以用熔解曲線分析進(jìn)一步確認(rèn)，利用SYBRGreenI這一特性建立的實(shí)時(shí)熒光PCR在 植物病原菌檢測(cè)方面已廣泛應(yīng)用。DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物技術(shù)的主要 原理為其引物包含兩個(gè)各自獨(dú)立的特異性引物區(qū)域，5'端序列由18-25個(gè)堿基組成并與 靶基因序列配對(duì)，3'端序列由6-12個(gè)堿基用來引導(dǎo)PCR反應(yīng)的特異性延伸，這兩段獨(dú)立的 特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤（Inosine，I)進(jìn)行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫 度低，在退火時(shí)寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結(jié)構(gòu)，從而使5'和3'區(qū)域形兩個(gè)獨(dú)立功能 的雙特異性引物結(jié)構(gòu)，并且研究表明5'和3'引物區(qū)域中任何有3個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配， PCR反應(yīng)將不能進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、具備定量能力、通用性 和實(shí)用性強(qiáng)的基于DP0引物的實(shí)時(shí)熒光PCR用于檢測(cè)屎腸球菌方法，本發(fā)明還提供了用于 該方法的DP0引物和含有該DP0引物的試劑盒。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 基于DP0引物的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)屎腸球菌的DP0引物， 所述DP0 引物上游引物EF-DP0-F設(shè)為SEQIDNO. 1，5'-GGCGGACATGCTAACCATTCAIII IICTGGGAAATC-3'，下游引物EF-DP0-R設(shè)為SEQIDΝ0· 2，5'-CCATCAATGGAGAATCTTGATTT GIIIIIGAGGTAATAGCHy，其中I堿基為次黃嘌呤。 一種檢測(cè)樣品中屎腸球菌的方法，該方法包括如下步驟： (1) 待測(cè)細(xì)菌樣品基因組DNA的提??； (2) 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：以含有DNA的樣品為模板與DP0引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)， 所述DPO引物為SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 ; (2)判斷待檢樣品。 所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：
所述實(shí)時(shí)熒光？〇?反應(yīng)的程序如下：95°(：預(yù)變性308、95°(：變性58、50-60°(：退火308、 72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，所述的退火溫度為55°C。 一種基于DP0引物或至少包含DP0引物的細(xì)菌樣品檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的有益效果包括：（1)本發(fā)明針對(duì)屎腸球菌的SodA基因設(shè)計(jì)特異性DP0引 物，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR法；（2)本發(fā)明將SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光PCR和DP0引物檢測(cè)技 術(shù)相結(jié)合，吸收了DP0引物高特異性且引物之間難以形成二聚體等優(yōu)點(diǎn)，成功建立了一種 特異性強(qiáng)、靈敏度高的屎腸球菌的檢測(cè)方法；（3)本發(fā)明的DP0引物的特異性在較低退火溫 度（50°C)和較高的退火溫度下（60°C)下結(jié)果一致，這大大增強(qiáng)了本發(fā)明的DP0引物和方 法在不同實(shí)驗(yàn)室之間的通用性；（4)本發(fā)明將DP0引物和SYBRGreenI的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié) 合起來，檢測(cè)結(jié)果易于判斷，無需凝膠電泳，這也增強(qiáng)了本方法的實(shí)用性。
【附圖說明】
[0007] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 圖1為特異性圖；其中1-10分別為為屎腸球菌（ATCC 35667)、糞腸球菌（ATCC 29212)、溶藻弧菌（ATCC 17749)、副溶血弧菌（ATCC17802)、奇異變形桿菌（ATCC 29245)、 大腸桿菌（ATCC 11229)、單增李斯特菌（ATCC 7644)、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213)、傷寒 沙門氏菌（ATCC 14028)、枯草芽孢桿菌（ATCC 21332)。 圖 2 為靈敏度圖；1-6 分別為 100ng/yL、10ng/yL、lng/yL、0.lng/yL、0. 01ng/yL、 0.OOlng/μL〇
【具體實(shí)施方式】 除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。
[0009] 本發(fā)明通過檢測(cè)屎腸球菌的SodA基因來檢測(cè)樣品中的屎腸球菌。由此，運(yùn)用本方 法可以快速的檢測(cè)出樣品中的屎腸球菌。
[0010] 本發(fā)明檢測(cè)屎腸球菌的SodA基因是通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR來實(shí)現(xiàn)的。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明針對(duì)屎腸球菌的SodA基因設(shè)計(jì)了特異性DP0引物。
[0012] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所用的特異性DP0引物包含SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明DP0引物的特異性在較低退火溫度（50°C)和較高的退火溫度下（60°C) 下的結(jié)果一致，這大大增強(qiáng)了本方法在不同實(shí)驗(yàn)室之間的通用性。
[0014] 在一個(gè)具體方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)樣品中屎腸球菌的方法，該方法包括： (1) 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng) 以含有DNA的樣品為模板與DP0引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，所述DP0引物為SEQID N0:1和SEQIDN0:2 ; (2) 判斷待檢樣品 在步驟（1)之前還可以包括DNA的提取步驟。
[0015] 所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：
[0016] 所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選如下：所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的程序如下： 95°C預(yù)變性 30s;95°C變性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)。
[0017] 下面參考具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng) 域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠 商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0018] 實(shí)施例1、本實(shí)施例提供了樣品中屎腸球菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟： 步驟一：基因組DNA的提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)為DP302) 對(duì)樣品提取DNA，參照說明書的要求操作。
[0019] 步驟二：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng) 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下：