基于dpo引物的實時熒光pcr檢測植物乳桿菌的方法、引物及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及菌株檢測領域，特別設及檢測樣品如微生物肥料、食品、醫(yī)用益生菌制 劑等中植物乳桿菌或者含有植物乳桿菌DNA的方法W及用于該方法的引物、含有該引物的 組合物和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌化actobacillusplantarum)是一種廣泛使用的益生菌，具有維持腸 道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力等功效，目前已經被應用于食品、醫(yī)用益生菌制劑等領域。 近年來，該菌的功能不斷被開發(fā)，目前植物乳桿菌已經應用在微生物肥料領域，對運些產品 中微生物的準確鑒定是產品質量控制的重要依據(jù)，因此建立一種快速、準確的鑒定方法具 有重要意義。
[0003] 目前植物乳桿菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)生理生化和分子生物學方法進行。
[0004] 傳統(tǒng)生理生化耗時耗力，而且由于乳桿菌屬許多種非常相似，生理生化特征也存 在許多相似之處，實際檢測過程中難W判斷，不能滿足實際檢測的需要。
[0005] 基于特異性引物的PCR的方法具備快速、準確、低成本的優(yōu)點，目前被廣泛用于轉 基因、食源性微生物、醫(yī)學病原菌等方面的檢測。目前PCR法已經被應用于植物乳桿菌的檢 測，楊小紅等建立了普通PCR法檢測植物乳桿菌，并用40株標準菌株驗證了方法的特異性， 并將該特異性引物成功轉化成為農業(yè)部標準NY/T2066-2011。W往報道的特異性引物檢測 植物乳桿菌使用的是普通引物，需要嚴格控制反應條件尤其是退火溫度，退火溫度的變化 可能會影響到引物的特異性，例如農業(yè)部標準NY/T2066-2011中所使用的植物乳桿菌特 異性引物W較高的退火溫度（67°C)來保證引物的特異性。而不同實驗室之間由于儀器、人 員等差異，可能會無法精確重復出試驗的各項條件，導致檢測特異性受到影響，可能照成誤 判，而且普通PCR法需要進一步凝膠電泳判斷結果，增加了檢測所需時間。
[0006] 實時巧光PCR中使用化qMan探針能檢測PCR中的特異性擴增產物，而不受非特異 性擴增產物的影響，因此被廣泛應用于微生物的定性及定量檢測，但一條有效的巧光探針 需要具備很高的保守性、合適的GC含量和長度、W及合適的Tm值等，而且不同乳桿菌之間 的差異較小，運使探針設計的難度大大增加。另外，探針合成的價格比較昂貴，因而在一定 程度上限制了特異性巧光探針的使用。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、具備定量能力、通用性 和實用性強的基于DP0引物的實時巧光PCR用于檢測植物乳桿菌的方法，本發(fā)明還提供了 用于該方法的DP0引物和含有該DP0引物的試劑盒。
[000引為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供了一種引物對，其中一條引物包含SEQIDNO:1所示的核巧酸序列，另 一條引物包含SEQIDNO:2所示的核巧酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述的引物對在制備檢測植物乳桿菌的試劑盒中的用途。
[0011] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中植物乳桿菌的試劑盒，所述試劑盒中 含有權利要求1所述的引物對。
[0012] 所述試劑盒還包括化q酶和d地2〇,所述化q酶優(yōu)選為與SYBR染料預混好的ExTaq 酶。
[0013] 所述試劑盒還包括細菌基因組DM提取試劑。
[0014] 更進一步的，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中植物乳桿菌的方法，包括使用上述的 引物對、上述試劑盒的步驟。
[0015] 上述檢測樣品中植物乳桿菌的方法優(yōu)選包括如下步驟：
[0016] 1)實時巧光PCR反應
[0017] W含有DNA的樣品為模板與DP0引物進行實時巧光PCR反應，所述DP0引物為SEQ IDNO:1 和沈QIDNO:2 ;
[0018] 2)判斷待檢樣品。
[0019] 優(yōu)選的，在步驟1)之前還包括DNA的提取步驟。
[0020] 優(yōu)選的，所述實時巧光PCR反應的反應體系如下：
[0021] SYB民PrcniixExTaq'j、！lO.uL 邱0引物 終濃度為0i2[imcd/L DNA模板 50ng ddt-W)補化中.20 .uL·,
[0022] 優(yōu)選的，所述實時巧光PCR反應的反應體系如下：所述實時巧光PCR反應的程序如 下：95°(：預變性303;95°(：變性53、50-60°(：退火303、72°(：延伸303,35個循環(huán)。
[0023] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0024] (1)本發(fā)明針對植物乳桿菌設計特異性DP0引物，建立了實時巧光PCR法，成功實 現(xiàn)了種水平的鑒定，其靈敏度高于農業(yè)部標準1個數(shù)量級。 陽02引 似本發(fā)明將SYBRGreenI實時巧光PCR和DP0引物檢測技術相結合，吸收了 DP0引物高特異性且引物之間難W形成二聚體等優(yōu)點，成功建立了一種特異性強、靈敏度 高、具備定量能力的植物乳桿菌的檢測方法。
[0026] (3)本發(fā)明的DP0引物的特異性在較低退火溫度（50°C)和較高的退火溫度下 (6(TC)下結果均與農業(yè)部標準一致，運大大增強了本發(fā)明的DP0引物和方法在不同實驗室 之間的通用性。
[0027] (4)本發(fā)明將DP0引物和SYBRGreenI的實時巧光PCR結合起來，檢測結果易于 判斷，無需凝膠電泳，運也增強了本方法的實用性。
【附圖說明】
[00測圖1是基于DP0引物的植物乳桿菌的實時巧光PCR的擴增曲線，其中橫坐標為循 環(huán)數(shù)，縱坐標為巧光值，其中1-13分別代表表1中1-13號菌株。
[0029] 圖2是采用本發(fā)明的DPO引物對梯度稀釋的植物乳桿菌的DM進行實時巧光PCR 的靈敏度檢測結果，其中從左至右的DM模板濃度依次為long/μLing/μLO.Ing/μL 0.Olng/μLO.OOlng/μL同時設置陰性對照。
[0030] 圖3為利用農業(yè)部標準NY/T2066-2011對梯度稀釋的植物乳桿菌的DM進行常 規(guī)PCR的靈敏度檢測結果，其中Μ代表MarkerDL2000 ;1-5的DNA模板濃度按順序從左至 右分別是lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μLO.OOlng/μL6 為陰性對照。
【具體實施方式】：
[0031] 除非特殊說明，本發(fā)明所用術語具有本發(fā)明所屬領域中的一般含義。
[0032] 植物乳桿菌作為益生菌被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域，因此建立運些產品 中植物乳桿菌的檢測方法具有重要意義。
[0033] 本發(fā)明通過檢測植物乳桿菌的23SrRNA基因來檢測樣品中的植物乳桿菌。由此， 運用本方法可W快速的檢測出樣品中的植物乳桿菌。
[0034] 本發(fā)明檢測植物乳桿菌的23SrRNA基因是通過實時巧光定量PCR來實現(xiàn)的。
[0035] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明針對植物乳桿菌的23SrRNA基因設計了特異性DP0引 物。
[0036] 在一個具體實施例中，所用的特異性DP0引物包含SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2 所示的核巧酸序列。
[0037] 本發(fā)明DP0引物的特異性在較低退火溫度（50°C)和較高的退火溫度下（60°C) 下的結果顯示與農業(yè)部標準一致，運大大增強了本方法在不同實驗室之間的通用性。
[0038] 在一個具體方面，本發(fā)明設及一種檢測樣品中植物乳桿菌的方法，該方法包括：
[0039] 1)實時巧光PCR反應
[0040] W含有DNA的樣品為模板與DP0引物進行實時巧光PCR反應，所述DP0引物為SEQ IDNO:1 和沈QIDNO:2 ;
[0041] 2)判斷待檢樣品
[0042] 在步驟1)之前還可W包括DNA的提取步驟。 陽0創(chuàng)所述實時巧光PCR反應的反應體系優(yōu)選如下：
[0044] SYB民PremixExT'aq'、i10 畔DPO引物終濃度為0.2μιηο1/1 DNA模板 50ng ddI-l2〇 i;i'化午.20p.U W45] 所述實時巧光PCR反應的反應體系優(yōu)選如下：所述實時巧光PCR反應的程序如下： 95°C預變性 30s;95°C變性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 個循環(huán)。
[0046] 上述提到的樣品可W包括但不限于是食品、醫(yī)用益生菌制劑、微生物肥料等。
[0047] 下面參考具體實施例和附圖，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，運些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領 域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠 商者，均為可w通過市購獲得的常規(guī)產品。 陽04引 實施例1
[0049] 本實施例提供了樣品中植物乳桿菌的檢測方法，包括如下步驟：
[0050] 步驟一：基因組DNA的提取
[005U 采用細菌基因組DM提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號為 DP302)對樣品提取DNA，參照說明書的要