奶牛脂肪肝疾病以及奶牛圍產(chǎn)期相關(guān)代謝疾病的牛血清microRNA分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)，提供了奶牛脂肪肝疾病以及奶牛圍產(chǎn)期相關(guān)代謝疾病的 牛血清microRNA分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪肝，是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多，使肝臟中脂肪含量超 過(guò)5% (占肝濕重的比例）的病變。脂肪肝是圍產(chǎn)期奶牛一種主要的代謝疾病，其發(fā)病率在世 界各地高低不一，大致范圍在30%~70%之間。我國(guó)奶牛脂肪肝的發(fā)病率超過(guò)30%，美國(guó)為 35.0%~66.0%。死亡率可高達(dá)25%。脂肪肝是圍產(chǎn)期奶牛一種主要的代謝疾病，尤其常高 發(fā)于高產(chǎn)奶牛?；贾靖尾〉哪膛＝】禒顩r和繁殖性能都會(huì)受到嚴(yán)重影響，且常伴隨有其 他疾病，如乳房炎、皺胃移位、胎衣不下和子宮炎等，甚至發(fā)展為酮病，使奶農(nóng)遭受巨大損 失。
[0003]目前，對(duì)于脂肪肝的診斷主要包括血液生化指標(biāo)檢測(cè)及影像學(xué)診斷。前者檢測(cè)血 液中相關(guān)的生化指標(biāo)，但是特異性相對(duì)較差;后者無(wú)創(chuàng)傷性、簡(jiǎn)單快速，但并不適用于奶牛， 有研究表明，奶牛肝臟甘油三酯含量與超聲波圖像之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。脂肪肝的診斷 金標(biāo)準(zhǔn)仍是肝臟穿刺活檢，肝活檢雖然可以準(zhǔn)確且較直觀地診斷奶牛脂肪肝，但會(huì)受到取 材部位及范圍等的影響，且對(duì)奶牛的應(yīng)激較大，不易被現(xiàn)場(chǎng)人員接受；另一方面，而且采肝 樣時(shí)需要熟練的操作技術(shù)，所以探究一種新的無(wú)創(chuàng)傷性的診斷方法是非常有必要的。該研 究的目的就是發(fā)掘一種血清學(xué)指標(biāo)用于便捷準(zhǔn)確地檢測(cè)、診斷奶牛是否患有脂肪肝。
[0004] miRNA是一類長(zhǎng)約2 2nt的非編碼RNA，通過(guò)抑制翻譯或降解mRNA控制基因表達(dá)。 miRNA可穩(wěn)定地存在于血漿和血清中而免受RNase的破壞，且在相同生理狀態(tài)的物種血清/ 血漿中表達(dá)水平非常穩(wěn)定。體液中的miRNA可能反映了組織中miRNA的變化水平，血清miRNA 表達(dá)水平與機(jī)體的生理狀態(tài)相關(guān)，血清miRNA作為疾病診斷標(biāo)志物已受到相當(dāng)關(guān)注。目前對(duì) 于人的酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝的診斷也正在開(kāi)發(fā)血清microRNAs作為分子診斷的 標(biāo)記。例如，在非酒精性脂肪肝病人的血清miR-16表達(dá)量顯著升高。另外，許多microRNAs與 肝臟的正常功能戚戚相關(guān)。miR-27a、miR-145和miR-378等于與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)，miR-122 和miR-33與脂質(zhì)代謝相關(guān)，miR-21、miR-29c和miR-194與肝臟脂肪變性相關(guān)。關(guān)于血清 miRNA與奶牛脂肪肝的關(guān)系目前未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明人在上述技術(shù)背景下，提供了奶牛脂肪肝疾病以及奶牛圍產(chǎn)期相關(guān) 代謝疾病的牛血清microRNA分子標(biāo)記，利用該分子標(biāo)記可以用于奶牛的品種選育和種質(zhì)改 良，并可在奶牛生長(zhǎng)實(shí)踐中對(duì)于患病牛的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，大大提高診斷的準(zhǔn)確性，可以極 大程度地避免經(jīng)濟(jì)損失。
[0006]本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記主要包括:成熟miRNAs的序列，其編號(hào)及對(duì)應(yīng)的核苷酸 序列為：
[0007] miR-16-5p，編號(hào)^ΠMAT0000785，其核苷酸序列如SEQN0·12所示；
[0008] miR-29c-3p，編號(hào)^ΠMAT0000803，其核苷酸序列如SEQN0·13所示；
[0009] 上述分子標(biāo)記是從如下備選分子標(biāo)記中篩選出來(lái)的：其編號(hào)及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列 為：
[0010] cel-miR-39-3p，編號(hào)^ΠMAT0000010，其核苷酸序列如SEQN0·ll所示；
[0011] miR-16-5p，編號(hào)^ΠMAT0000785，其核苷酸序列如SEQN0.12所示；
[0012] miR-29c-3p，編號(hào)^ΠMAT0000803，其核苷酸序列如SEQN0·13所示；
[0013] miR-21-3p，編號(hào)^ΠMAT0004711，其核苷酸序列如SEQN0·14所示；
[0014] miR-27a-3p，編號(hào)^ΠMAT0000799，其核苷酸序列如SEQN0·15所示；
[0015] miR-33-5p，編號(hào)^ΠMAT0000812，其核苷酸序列如SEQN0.16所示；
[0016] miR-122-5p，編號(hào)^ΠMAT0000827，其核苷酸序列如SEQN0·17所示；
[0017] miR-145-5p，編號(hào)^ΠMAT0000951，其核苷酸序列如SEQN0·18所示；
[0018] miR-194-5p，編號(hào)^ΠMAT0000969，其核苷酸序列如SEQN0·19所示；
[0019] miR-378a-3p，編號(hào)ΜΠ1ΑΤ0003379,其核苷酸序列如SEQN0.20所示。
[0020] 除此之外，本發(fā)明的發(fā)明人還針對(duì)上述成熟miRNAs的序列，公開(kāi)了其前體序列以 及miRNAs表達(dá)檢測(cè)所用的引物序列，具體如下：
[0021] 上述分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的前體，其編號(hào)及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：
[0022] cel-miR-39-3p，編號(hào)MI0000010,其核苷酸序列如SEQN0.1 所示；
[0023] miR-16-5p，編號(hào)MI0000844,其核苷酸序列如SEQN0.2所示；
[0024] miR-29c-3p，編號(hào)MI0000865,其核苷酸序列如SEQN0.3所示；
[0025] miR-21-3p，編號(hào)MI0000850,其核苷酸序列如SEQN0.4所示；
[0026] miR-27a-3p，編號(hào)MI0000860,其核苷酸序列如SEQN0.5所示；
[0027] miR-33-5p，編號(hào)MI0000874,其核苷酸序列如SEQN0.6所示；
[0028] miR-122-5p，編號(hào)MI0000891，其核苷酸序列如SEQN0.7所示；
[0029] miR-145-5p，編號(hào)MI0000918,其核苷酸序列如SEQN0.8所示；
[0030] miR-194-5p，編號(hào)MI0000937,其核苷酸序列如SEQN0.9所示；
[0031]miR-378a-3p，編號(hào)MI0003719，其核苷酸序列如SEQN0·10所示。
[0032]所述的分子標(biāo)記的表達(dá)檢測(cè)所用的引物，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：
[0033]cel-miR-39-3p-F，其核苷酸序列如SEQN0·21所示；
[0034] miR-16-5p-F，其核苷酸序列如SEQN0.22所示；
[0035] miR-29c-3p-F，其核苷酸序列如SEQN0·23所示；
[0036] miR-21-3p-F，其核苷酸序列如SEQN0·24所示；
[0037] miR-27a-3p-F，其核苷酸序列如SEQN0·25所示；
[0038] miR-33-5p-F，其核苷酸序列如SEQN0·26所示；
[0039] miR-122-5p-F，其核苷酸序列如SEQN0·27所示；
[0040]miR-145-5p-F，其核苷酸序列如SEQN0.28所示；
[0041 ]miR-194-5p-F，其核苷酸序列如SEQN0.29所示；
[0042]miR-378a-3p-F，其核苷酸序列如SEQN0·30所示。
[0043]為了驗(yàn)證上述分子標(biāo)記的作用，發(fā)明人采集了131頭產(chǎn)后60天內(nèi)（以分娩日期為第 1天，泌乳天數(shù)為35.5±21.9天)奶牛的血清，根據(jù)血清游離脂肪酸(NEFA)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)和血清葡萄糖(Glu)三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷，將131頭奶牛分別為疑似奶牛脂肪肝群和正 常肝臟奶牛群，然后在疑似脂肪肝群和正常奶牛群中分別選擇指標(biāo)極端個(gè)體分為正常奶牛 對(duì)照組和脂肪肝奶牛試驗(yàn)組（各8頭），以cel-miR-39-3p為內(nèi)參基因，分別進(jìn)行了上述9種 miRNAs的血清學(xué)表達(dá)檢測(cè)，它們是111丨1?-21-3?、111丨1?-273-3?、111丨1?-3783-3?、111丨1?-122-5?、11^1?-29c-3p、miR-16-5p、miR-33-5p、miR-194_5p和miR-145_5p。
[0044] 結(jié)果顯示：與正常奶牛個(gè)體相比，miR-16-5p和miR-29c-3p(miR-16-5p，編號(hào) Μ頂AT0000785，其核苷酸序列如SEQ N0.12所示;miR-29c-3p，編號(hào)MIMAT0000803，其核苷酸 序列如SEQ勵(lì).13所示)在脂肪肝奶牛個(gè)體中表達(dá)極顯著降低(？〈0.01)，這兩個(gè)!^1?熟8可以 作為奶牛脂肪肝的分子診斷標(biāo)記;并由此本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記可以在奶牛的品種選育 和種質(zhì)改良上的應(yīng)用;還可以在制備奶牛脂肪肝疾病以及奶牛圍產(chǎn)期相關(guān)代謝疾病的早期 診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0045]綜上所述，用本發(fā)明所提供的microRNA分子標(biāo)記作為診斷標(biāo)記不僅方法簡(jiǎn)便快 速，有助于在奶牛生長(zhǎng)實(shí)踐中對(duì)于患病牛的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，而且可大大提高診斷的準(zhǔn)確 性，可以極大程度地避免經(jīng)濟(jì)損失，并且可以未來(lái)可用于奶牛的品種選育和種質(zhì)改良以及 奶牛脂肪肝疾病以及奶牛圍產(chǎn)期相關(guān)代謝疾病的早期診斷試劑盒的制備。
【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1為正常奶牛與脂肪肝奶牛血清中miRNA的相對(duì)表達(dá)情況柱狀圖，
[0047]圖2為miR-16-5p作為分子標(biāo)記診斷脂肪肝的R0C曲線圖；
[0048]圖3為miR-29c-3p作為分子標(biāo)記診斷脂肪肝的R0C曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]實(shí)施例1.圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝患病與否的預(yù)診斷以及極端患病個(gè)體和正常個(gè)體的 選擇
[0050] 1.樣品米集
[0051]試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自山東泰安A養(yǎng)殖場(chǎng)和山東青島B養(yǎng)殖場(chǎng)。選取的131頭泌乳早期（以分 娩日期為第1天，泌乳天數(shù)為35.5±21.9天）的中國(guó)荷斯坦奶牛。自由采食，飲水。采集樣品 日早晨飼前進(jìn)行采血20ml，無(wú)抗凝室溫靜置lh后，4°C3000rpm離心取血清，分裝后置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0052] 2.試劑
[0053]游離脂肪酸(NEFA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶IFCC法檢測(cè)試劑盒（四川省邁克科技有限責(zé)任公司）；血糖(G0D-PAP)法測(cè)定試劑盒（四川省邁克 科技有限責(zé)任公司）。
[0054] 3.生化指標(biāo)檢測(cè)
[0055] 使用NEFA測(cè)試盒，采用比色法，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清NEFA含量;使用AST和Glu測(cè)定 試劑盒，在日立7020全自動(dòng)生化分析儀中測(cè)定血清AST和Glu含量，根據(jù)Reid等報(bào)道(Reid，I.jS.DeWjR.CollinSjM.Ducker,G.Bloomfield,andS·Morant·Therelationship betweenfattyliverandfertilityindairycows:Afarminvestigation!!J] ?JournalofAgricultureScience. ,1983,101:499-502·)將NEFA、AST和Glu的測(cè)定值代 入公式Y(jié)= -0·51-0·003NEFA+2·84Glu-0·0528AST中，計(jì)算Y值。若Y> 1 為正常肝臟;若0<Y <1為輕度脂肪肝;若Υ<〇為重度脂肪肝。然后，選取8頭重度脂肪肝奶牛(Υ〈0)和8頭健康奶 牛(Υ>1)分別作為試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行血清學(xué)標(biāo)記表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)。
[0056] 4.統(tǒng)計(jì)分析
[0057]試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（'X土S)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS17.0軟件中one-wayAN0VA進(jìn)行分析，P〈0.05為差異顯著，P〈0.01為差異極顯著。
[0058] 5.圍產(chǎn)期奶牛血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與分析
[0059] 本試驗(yàn)根據(jù)血清中幾種主要生化指標(biāo)的變化來(lái)診斷脂肪肝，因?yàn)檠撬降母叩?是反應(yīng)分娩后機(jī)體體況的重要指標(biāo)，而且可以衡量產(chǎn)后奶牛是否能量處于負(fù)平衡狀態(tài);血 清中NEFA值的高低是反應(yīng)機(jī)體動(dòng)用體脂的情況，即是一個(gè)反應(yīng)機(jī)體是否動(dòng)用體脂的重要指 標(biāo);而AST則是反應(yīng)肝臟損傷的重要指標(biāo)。有人用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析法發(fā)現(xiàn)，上述三種指標(biāo)和組織 學(xué)檢查法符合率為85%，所以可以說(shuō)利用血液生化分析法來(lái)診斷奶牛脂肪肝是一種切實(shí)可 行的方法。將各受試奶牛測(cè)得的NEFA、Glu和AST值代入公式Y(jié)= -0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.0528AST中，當(dāng)Υ> 1時(shí)為正常;Υ&