0042]實(shí)施例5在不同的pH條件下制備S-苯乙?；状?br>[0043] 將苯甲醛42.4mg、丙酮酸鈉52.8mg、TPP(焦磷酸硫胺素)2mg、硫酸鎂2mg、丙酮酸脫 羧酶EW091420mg，加入到2mL 0.1M不同pH的roS緩沖溶液中，在20°C溫度條件下，反應(yīng)24小 時(shí)，苯甲醛的轉(zhuǎn)化率如表5:
[0044]表 5 「00451

[0046]~~從表5中可知，在其他條件不變的情況下，在pH為6.0時(shí)，苯甲醛的轉(zhuǎn)化率最高。~ [0047]實(shí)施例6助溶劑對(duì)反應(yīng)的影響
[0048] 將苯甲醛42.4mg、丙酮酸鈉52.8mg、TPP(焦磷酸硫胺素）2mg、硫酸鎂2mg，丙酮酸脫 羧酶l〇mg，加入到1.8mL pH 6.00.1M PBS緩沖溶液中，而后再加入0.2mL不同的有機(jī)溶劑， 在20°C溫度條件下，反應(yīng)24小時(shí)，檢測(cè)苯甲醛的轉(zhuǎn)化率如表6:
[0049] 表 6
[0050]
'[00511 ~從表6中誄知，在反應(yīng)程中，添加乙1腈或甲醇或DMS0W機(jī)溶劑，可使1 得苯甲醛的1 轉(zhuǎn)化率提高。
[0052]實(shí)施例7丙酮酸鈉用量的優(yōu)化
[0053]將苯甲醛42.4mg、不同量的丙酮酸鈉、TPP(焦磷酸硫胺素）2mg、硫酸鎂2mg、丙酮酸 脫羧酶EW091410mg，加入到1.8mL pH 6.00.1M PBS緩沖溶液中，再加入0.2mL DMS0,在20°C 溫度條件下，反應(yīng)24小時(shí)，檢測(cè)苯甲醛的轉(zhuǎn)化率如表7:
[0054] 表 7
[0055]
'[0056]~從表7中^知，在其1他條件相同心情況下，采^2.0當(dāng)量的k酮酸鈉，苯1甲醛的轉(zhuǎn)化 1 率最高。
[0057]實(shí)施例8采用丙酮酸鈉制備S-苯乙酰基甲醇的放大反應(yīng)
[0058] 將苯甲醛2.6g、丙酮酸鈉30g加入裝有500mL pH 6.00.1M PBS緩沖溶液的1L反應(yīng) 器中，加入TPP(焦磷酸硫胺素)0.23g、硫酸鎂0.445g、丙酮酸脫羧酶EW09145g，在20°C溫度 條件下開始反應(yīng)，并采用流加的方式加入苯甲醛13.3g，10h加完，24小時(shí)后檢測(cè)苯甲醛轉(zhuǎn)化 率為99%。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液采用硅藻土過(guò)濾，并用等體積的乙酸乙酯萃取3次，采用飽和 食鹽水洗滌有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)干燥、旋蒸后得到產(chǎn)品18g，ee值99%，純度97%。
[0059] 實(shí)施例9采用乙醛制備S-苯乙?；状嫉姆糯蠓磻?yīng)
[0060] 將苯甲醛2.6g加入到裝有400mL pH 6.00.1M PBS緩沖溶液的1L反應(yīng)器中，而后加 入TPP(焦磷酸硫胺素)0.23g、硫酸鎂0.445g、丙酮酸脫羧酶EW09145g，在20°C溫度下開始反 應(yīng)，并采用流加的方式加入13.38苯甲醛和45 835%乙醛與5511^?83緩沖溶液的混合物， l〇h加完，24小時(shí)后檢測(cè)苯甲醛轉(zhuǎn)化率為99%。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液采用硅藻土過(guò)濾，而后 采用等體積的乙酸乙酯萃取3次，飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，有機(jī)相干燥、旋蒸得到產(chǎn)品19g， ee值99 %，純度97 %。該產(chǎn)品的HPLC圖譜參見圖1所示。
[0061 ]實(shí)施例10實(shí)施例8和實(shí)施例9的后續(xù)反應(yīng)
[0062] 取實(shí)施例8和實(shí)施例9中所制得的產(chǎn)品6mg加入到lmL pH 0.1M緩沖溶液中，而后加 入異丙胺23.6mg、PLP 0 . lmg、轉(zhuǎn)氨酶（購(gòu)自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號(hào)為EW037或 EW038)lmg，在30°C溫度條件下反應(yīng)24小時(shí)，檢測(cè)到底物轉(zhuǎn)化率為100%，產(chǎn)物ee值分別為 99% (R構(gòu)型和S構(gòu)型，如下式）。
[0063]
[0064] 上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明 精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒?，其特征在于:在焦磷酸硫胺素、無(wú)機(jī)鹽及丙 酮酸脫羧酶的存在下，在溫度為15~30°C、pH為6.0~7.0的緩沖溶液中，苯甲醛與丙酮酸鈉或 乙醛發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)生成S-苯乙酰基甲醇，其中，所述的苯甲醛的投加濃度為1~30g/L， 所述的無(wú)機(jī)鹽為選自鎂、鐵、銅、鋅、錳的金屬的硫酸、鹽酸或磷酸鹽中的一種或多種的混合 物，所述的焦磷酸硫胺素的投加濃度為0.5~5mg/mL，無(wú)機(jī)鹽的投加濃度為0.1~3mg/mL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙酰基甲醇的方法，其特征在于:所述丙酮酸 脫氫酶與所述苯甲醛的投料質(zhì)量比為〇. 5~1.5:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物法制備S-苯乙酰基甲醇的方法，其特征在于:所述的 丙酮酸脫羧酶為購(gòu)自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號(hào)為EW0914的丙酮酸脫氫酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒ǎ涮卣髟谟?所述的丙酮 酸鈉或乙醛與所述苯甲醛的投料摩爾比為1~2.0:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒?，其特征在于:所述的丙酮 酸鈉或乙醛與所述苯甲醛的投料摩爾比為1.6~2.0:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒ǎ涮卣髟谟?使所述反應(yīng) 在助溶劑條件下進(jìn)行，所述的助溶劑為乙腈、甲醇、二甲基亞砜中的一種或多種的組合。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒?，其特征在于:所述的緩沖 溶液為磷酸緩沖液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙酰基甲醇的方法，其特征在于:在溫度20~ 25°C條件下進(jìn)行所述反應(yīng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒?，其特征在于:所述的無(wú)機(jī) 鹽為硫酸鎂。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物法制備S-苯乙酰基甲醇的方法，其特征在于，具體實(shí)施 過(guò)程如下:將所述的苯甲醛、丙酮酸鈉或乙醛、焦磷酸硫胺素、無(wú)機(jī)鹽、丙酮酸脫羧酶加入到 所述緩沖溶液中，控制反應(yīng)溫度在15~30°C間，攪拌反應(yīng)，利用HPLC/MS檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng) 結(jié)束后，采用硅藻土過(guò)濾、萃取，有機(jī)相洗滌、干燥、旋蒸獲得產(chǎn)物S-苯乙?；状?。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物法制備S-苯乙?；状嫉姆椒?，在焦磷酸硫胺素、無(wú)機(jī)鹽及丙酮酸脫羧酶的存在下，在溫度為15~30℃、pH為6.0~7.0的緩沖溶液中，苯甲醛與丙酮酸鈉或乙醛發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)生成S-苯乙?；状?，其中，所述的苯甲醛的投加濃度為1~30g/L，所述的無(wú)機(jī)鹽為選自鎂、鐵、銅、鋅、錳的金屬的硫酸、鹽酸或磷酸鹽中的一種或多種的混合物，所述的焦磷酸硫胺素的投加濃度為0.5~5？mg/mL，無(wú)機(jī)鹽的投加濃度為0.1~3？mg/mL。該方法采用的底物濃度高、產(chǎn)物ee值高、副產(chǎn)物很少，產(chǎn)品成本低。
【IPC分類】C12P7/26
【公開號(hào)】CN105483163
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511024261
【發(fā)明人】陶軍華, 樂庸堂, 梁曉亮
【申請(qǐng)人】蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日