檢測食源性致病菌的試劑盒及多重?zé)晒鈖cr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測食源性致病菌的試劑盒及多重?zé)晒釶CR檢測方法；該檢測方 法結(jié)核高分辨率熔解曲線HRM分析和熒光PCR技術(shù)，本方法可檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球 菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌及大腸桿菌〇157:H7五種主要食源性致病菌中的一種或 兩種以上至五種食源性致病菌，屬于微生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 2014年7月1日，國家衛(wèi)計委發(fā)布的強(qiáng)制性食品安全標(biāo)準(zhǔn)"GB29921-2013《食品 中致病菌限量》"正式實施，該標(biāo)準(zhǔn)涉及五種食源性致病菌，即本專利所述沙門氏菌、金黃色 葡萄球菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌以及大腸桿菌0157:H7。
[0003] 其中，沙門氏菌（Salmonella)屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌，已發(fā)現(xiàn)的近 一千種。沙門氏菌病除可感染人外，還可感染很多動物，包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類 及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病。蛋、家禽和 肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，該病受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個 體。根據(jù)國際慣例，要求對易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理，從而有效預(yù)防沙門氏菌 病。
[0004] 副溶血弧菌（VibrioParahemolyticus)，是一種嗜鹽性細(xì)菌，系弧菌科弧菌屬， 革蘭染色陰性。進(jìn)食含有該菌的食物可食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒，主要來自海產(chǎn)品。 臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌主要來源于魚、 蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來 由于海鮮空運(yùn)，內(nèi)地城市病例也漸增多。
[0005] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡 萄球菌屬，有"嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。金黃色葡萄 球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。因此，食品受到 污染的機(jī)會很多。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位。金黃 色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點：季 節(jié)分布，多見于春夏季；中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯 米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化 膿性感染部位，常成為污染源。
[0006] 單增李斯特菌是是某些食物（主要是鮮奶產(chǎn)品）中的一種污染物，能引起嚴(yán)重食 物中毒。也是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增 多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4°C 的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。
[0007] 熒光PCR檢測技術(shù)大致分為兩大類：熒光探針法（標(biāo)記熒光PCR)和非標(biāo)記熒光染 料法。前者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者弓I物來識別模板，優(yōu)點是特異性更高，適用 于擴(kuò)增序列專一檢測，不過檢測成本高。后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā) 光的特性來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，無需另外合成探針，簡便易行，成本較低。相對以往普通 非探針標(biāo)記熒光PCR所用非飽和染料，新型飽和燃料（如LCGreen等）具有以下優(yōu)點：① 新型飽和染料對PCR反應(yīng)沒有任何抑制作用。②DNA高溫變性時，非飽和熒光染料加入則 會造成DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結(jié)合 到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染 料則不會出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對于高GC含量的PCR產(chǎn)物，在DNA雙鏈高溫熔解時， 飽和突光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。
[0008]目前，食源性致病菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和分子檢測方法。其中 傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離檢測方法，依賴于生化和形態(tài)學(xué)特點，我國以GB4789系列國家食品安全 標(biāo)準(zhǔn)作為經(jīng)典方法，規(guī)范了食源性致病菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法，分子檢測方法則主要為SN/T 1870-2007《食品中致病菌檢測方法實時PCR法》。但傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在操作繁瑣、耗時長、易 漏檢等缺點。分子檢測方法包括了常規(guī)PCR方法和探針法熒光PCR方法，常規(guī)PCR需要擴(kuò) 增后進(jìn)行電泳，操作復(fù)雜且易引起污染。而探針法PCR則存在檢測成本很高，試劑保存期短 等缺點。
[0009] 研究人員對此已開展了許多方法研究，但是同時針對這五種食源性致病菌開展多 重?zé)晒釶CR檢測的研究尚未見報道

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，成本 低的檢測食源性致病菌的試劑盒；
[0011] 本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒的多重?zé)晒釶CR檢測主要食源性 致病菌的方法，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
[0012] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0013] 一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成：
[0014]
【主權(quán)項】
1. 一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成： HRM反應(yīng)預(yù)混液 10 μ L(終濃度I X ) dNTPs混合液 2.0 μ L(終濃度0.2 mM) Taq聚合酶 0 5 μ L(終濃度0.1 U/ μ L) 上游引物 0.5 wL01^j.i〇.5pmol/L) 下游引物 0.5 uL(終濃度0 5pmol/L) 熒光染料 1 μL(終濃度IX) DNA模版 I UL 水 2 5 μ L 。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述的上游引 物包括沙門氏菌目的基因16 s RNA上游引物SLMF : 5 ' -GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3 ' ； 所述下游引物包括沙門氏菌目的基因16s RNA上游引物SLMR: 5 '-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物 還包括金黃色葡萄球菌的目的基因16s RNA上游引物SPAF :5 '-CCTAATCAGAAAGCCACG-3'， 所述下游引物還包括黃色葡萄球菌的目的基因16s RNA下游引物SPAR : 5 '-AGTTTCCAATGACCCTCC-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游 弓丨物還包括副溶血性弧菌目的基因 TLH上游引物VPF : 5 ' CAAACCAGCAAACACCTT-3 ';所述下 游引物還包括副溶血性弧菌目的基因 TLH下游引物VPR : 5 'GTCCGTCAAACGAATCAG-3 '。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引 物還包括單增李斯特菌目的基因16s RNA上游引物L(fēng)MOF :5 '-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3'， 所述下游引物還包括單增李斯特菌目的基因16s RNA下游引物L(fēng)MOR : 5 '-GTTCCTCCACATATCTACGC-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于所述上游引物 還包括大腸桿菌〇157:H7目的基因 rfbE上游引物0157F :5 '-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3'， 所述下游引物還包括大腸桿菌〇157:H7目的基因 rfbE下游引物0157R : 5 '-GACATTTGCCAAGTTTCA-3'。
7. -種多重?zé)晒釶CR檢測方法，其特征在于包括以下步驟： A、 根據(jù)食源性致病菌設(shè)計引物對； B、 提取樣本DNA后，利用設(shè)計的引物對進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增； C、 應(yīng)用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物Tm 值； 其中步驟B中進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增過程中的反應(yīng)液由以下組分組成： HRM反應(yīng)預(yù)混液 10 μLχ終濃度I X) dNTPs混合液 2.0 μLχ終濃度0.2 mM) Taq聚合酶 0.5 μLχ終濃度0.1 1%L) 上游引物 0.5 μL(終濃度0.5 pmo丨/L) 下游引物 0.5 pL(終濃度0.5 pmol/L) 熒光染料 IpL(終濃度IX) DNA模板 I gL 水 2.5 μΕ 〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測方法，其特征在于步驟B中對所有致 病菌檢測時PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序按以下步驟進(jìn)行： (1) 92°C ~96°C預(yù)變性 30s ; (2) 92°C ~96°C變性 10 ~30s，55°C -63°C退火 10 ~30s，72°C 10 ~30s，共進(jìn)行 40 ~ 50個循環(huán)； (3) 72°C延伸 10 ~30s。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測方法，其特征在于步驟C中對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，按以下步驟進(jìn)行： (1) 92°C~96°C變性 Imin ; (2) 40°C復(fù)性 Imin ; (3) 初始熔解溫度60°C~65°C，開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測 突光信號，15~25次/秒。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種多重?zé)晒釶CR檢測方法，其特征在于所述熒光染料為 Eva Green染料、LC Green? PLUS染料、SYT09染料中的一種或者兩者以上的混合物；所述 dNTP 混合液為由各 2. 5mM 的 dATP、dCTP、dTTP、dGTP 組成。
【專利摘要】本發(fā)明新型公開了一種檢測食源性致病菌的試劑盒及多重?zé)晒釶CR檢測方法；該檢測食源性致病菌的試劑盒，其特征在于由以下組分組成：HRM反應(yīng)預(yù)混液；dNTPs混合液；Taq聚合酶；上游引物；下游引物；熒光染料；DNA模版；水。本發(fā)明一種多重?zé)晒釶CR檢測方法，其特征在于包括以下步驟：提取樣品DNA；對樣品DNA進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，擴(kuò)增后對產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析后判定結(jié)果。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，成本低的檢測食源性致病菌的試劑盒；本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒的多重?zé)晒釶CR檢測主要食源性致病菌的方法，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-14, C12Q1-04, C12Q1-10
【公開號】CN104651487
【申請?zhí)枴緾N201410621337
【發(fā)明人】蔡先全, 李蓉, 邱德義, 魚海瓊, 柏建山, 岳巧云, 趙美轉(zhuǎn), 蕭綺倩, 張磊
【申請人】蔡先全
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年11月5日