一種鑒定食源性致病菌特異性引物及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定食源性致病菌特異性引物及其應(yīng) 用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠟樣芽孢桿菌是芽胞桿菌屬中的一種，是引起人類食源性疾病的主要原因之一， 引起食物中毒的癥狀為腹痛、嘔吐、腹瀉。發(fā)明用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)法檢測(cè)食源性致 病菌，該方法要求引物特異性強(qiáng)，具有許多傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明的這套引物 對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)法檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌，有特異性高、反應(yīng)快速高效、靈敏度高、操 作簡(jiǎn)單、鑒定簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。目前還沒(méi)有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)法快速準(zhǔn)確檢測(cè)蠟樣芽孢 桿菌的此套引物的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種鑒定食源性致病菌特異性引物及其應(yīng)用方法， 旨在解決現(xiàn)有缺少采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌引物方法的問(wèn)題。
[0004] 本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鑒定食源性致病菌特異性引物，該LAMP檢測(cè)蠟 樣芽孢桿菌的特異性引物序列為：
[0005] F3 :CGATTGATGGTGCGGTTA、
[0006] B3 :CAGTTCTTTGACCTTTGTCA、
[0007] FIP ：TGCTTTGTTTCAGGTGTATCAACCATTAATGTACAAAGGTCAACC
[0008] BIP :AAGGTGTAGAGAAATATGGTACTGATCGACTTCAATTTTCTTTGCA。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒定食源性致病菌特異性 引物的方法，所述采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒定食源性致病菌特異性引物的方法包括以下步 驟：
[0010] 1.在生物公司合成該特異性引物，用無(wú)菌的雙蒸水將引物溶解至20umol/L，保存 于-20°C ;
[0011] 2.按照環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)試驗(yàn)反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)反 應(yīng)體系組成成分：本發(fā)明的特異性引物？1?、81?43、83各2111 ;(1階1^4.〇111;1\11^1'111〇?〇1 Buffer 2. 5ul ;DNA 模板 4. Oul ;Bst DNA 聚合酶 1.0 ul ;Betaine5. Oul ;ddH20 0· 5ul。擴(kuò)增 溫度：60°C ;擴(kuò)增時(shí)間60min ;
[0012] 3.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)結(jié)果于2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察， 比較體系在引物作用下擴(kuò)增情況或直接觀察白色沉淀來(lái)鑒定陽(yáng)性結(jié)果。
[0013] 本發(fā)明提供的鑒定食源性致病菌特異性引物及其應(yīng)用方法，所述鑒定食源性致病 菌特異性引物可以快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌DNA，檢測(cè)的特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)方 法操作簡(jiǎn)單；檢測(cè)的反應(yīng)時(shí)間短，只需1小時(shí)。反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，只需在溫度恒定條件；檢測(cè)高 效，結(jié)果可以快速直觀的通過(guò)觀測(cè)沉淀來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性鑒定結(jié)果；引物對(duì)LAMP法檢測(cè)蠟樣芽孢 桿菌，可以在恒定溫度60度條件下反應(yīng)，需要的反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，無(wú)需PCR等昂貴的儀器實(shí)施 檢測(cè)，檢測(cè)只需恒溫水浴鍋，儀器成本低。本發(fā)明一小時(shí)就能完成目的菌株的檢測(cè)，耗時(shí)短， 比PCR等檢測(cè)技術(shù)節(jié)省2至3小時(shí)。本發(fā)明特異性強(qiáng)，可以對(duì)引物鑒定的蠟樣芽孢桿菌特 異性檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，可以檢測(cè)出低濃度的蠟樣芽孢桿菌的DNA，操作簡(jiǎn)單，可以 目測(cè)反應(yīng)的沉淀來(lái)判定陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，鑒定快速簡(jiǎn)便。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1本發(fā)明實(shí)施例提供的鑒定食源性致病菌特異性引物的應(yīng)用方法流程圖；
[0015] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物作用下擴(kuò)增情況示意圖；
[0016] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的特異性引物1做10株菌的LAMP反應(yīng)不意圖；
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0018] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)反應(yīng)的引物為：
[0019] F3 :CGATTGATGGTGCGGTTA、
[0020] B3 :CAGTTCTTTGACCTTTGTCA、
[0021] FIP ：TGCTTTGTTTCAGGTGTATCAACCATTAATGTACAAAGGTCAACC
[0022] BIP :AAGGTGTAGAGAAATATGGTACTGATCGACTTCAATTTTCTTTGCA。
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 一種食源性致病菌的分離及分子鑒定：
[0026] (1)從雞蛋表層分離得到1株菌，經(jīng)純培養(yǎng)后對(duì)其進(jìn)行DNA提取，再進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA 片段 PCR 擴(kuò)增；PCR 的正向引物：Eu27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'ΙΟμΜ);反向 引物：1490R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'ΙΟμΜ) ;PCR 擴(kuò)增條件：95°C預(yù)熱 5min，95°C變 性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。在生物技術(shù)有限公司 對(duì)目的基因測(cè)序；
[0027] 通過(guò)16S rRNA序列經(jīng)校對(duì)后，與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)做相似性分析，選取相似 度 100%的菌株結(jié)果為：Bacillus cereus strain BAB-806。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 引物篩選實(shí)驗(yàn)，方法為：
[0030] 按照環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)試驗(yàn)反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)試驗(yàn)反應(yīng)體系組成成分：FIP、BIP、F3、B3 ;dNTPs ;1 X Thermopol Buffer ;DNA 模板； Bst DNA聚合酶；Betaine ;ddH20，擴(kuò)增溫度：60°C ;擴(kuò)增時(shí)間60min。反應(yīng)體系如下表：
[0031] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)反應(yīng)體系，如表1
[0032] 表 1
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定食源性致病菌特異性引物，其特征在于，所述鑒定食源性致病菌特異性引 物引物為： F3 :CGATTGATGGTGCGGTTA、 B3 ：CAGTTCTTTGACCTTTGTCA, FIP ：TGCTTTGTTTCAGGTGTATCAACCATTAATGTACAAAGGTCAACC BIP :AAGGTGTAGAGAAATATGGTACTGATCGACTTCAATTTTCTTTGCA。
2. -種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒定食源性致病菌特異性引物的方法，其特征在于，所述 采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒定食源性致病菌特異性引物的方法包括以下步驟： 步驟一，合成特異性引物，用無(wú)菌的雙蒸水將引物溶解至20umol/L，保存于-20°C ; 步驟二，按照環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)反應(yīng)體系 組成成分：特異性引物？1?、81?、？3、83各2111;(1階1 38 4.〇111;1\11161'111(^〇181^€612.5111; DNA 模板 4. Oul ;Bst DNA 聚合酶 1.0 ul ;Betaine 5. Oul ;ddH20 0? 5ul，擴(kuò)增溫度：60°C ;擴(kuò) 增時(shí)間60min ; 步驟三，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果于2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察，比較體 系在引物作用下擴(kuò)增情況或直接觀察白色沉淀來(lái)鑒定陽(yáng)性結(jié)果。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定食源性致病菌特異性引物及其應(yīng)用方法，引物為F3：CGATTGATGGTGCGGTTA、B3：CAGTTCTTTGACCTTTGTCA、FIP：TGGTTTGTTTCAGGTGTATCAACCATTAATGTACAAAGGTCAACC；BIP：AAGGTGTAGAGAAATATGGTACTGATCGACTTCAATTTTCTTTGCA。該應(yīng)用方法包括合成特異性引物，用無(wú)菌的雙蒸水將引物溶解至20umol/L，保存于-20℃；按照環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果于2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察。本發(fā)明的引物有特異性高強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-04, C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-085
【公開(kāi)號(hào)】CN104805213
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510240001
【發(fā)明人】李玉鋒, 趙軍, 李楨, 宋小寧, 王征征, 陳澤平, 劉艷全
【申請(qǐng)人】西華大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年5月10日