一種成纖維細胞誘導分化為多功能干細胞的方法
【專利說明】一種成纖維細胞誘導分化為多功能干細胞的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種成纖維細胞誘導分化為多功能干細胞的方法，具體涉及的是一種白癜風病人皮損處皮膚成纖維細胞誘導為多功能干細胞的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]白癜風(vitiligo)是一種常見的局部或全身色素脫失性皮膚病，該病發(fā)病率約為0.5-2%，臨床表現(xiàn)為色素脫失，及白斑形成，邊緣較清晰。白癜風的發(fā)病機制不是很明確，近年來研究與遺傳因素、自身免疫因素、氧化應(yīng)激反應(yīng)、黑素細胞自身破壞以及精神神經(jīng)因素等方面有關(guān)。該病治療方法有多種，包括藥物治療、物理治療、外科手術(shù)治療等，但效果并不十分理想，對患者的生活造成一定影響。
[0004]用干細胞進行疾病治療的研究近年來已有許多成果，對于白癜風的治療也可以利用干細胞來實現(xiàn)。由于白癜風病人皮損處的黑素細胞功能下降甚至缺失，可以利用干細胞誘導出黑素細胞后進行相關(guān)治療。目前誘導分化出黑素細胞的干細胞有胚胎干細胞(EScell)、繆斯細胞(Muse cell)、間充質(zhì)干細胞(MSC)、誘導多功能干細胞(iPS cell)。
[0005]誘導多功能干細胞首先是由日本科學家Yamanaka利用小鼠成纖維細胞誘導出來的(Takahashi，K.and S.Yamanaka, Induct1n of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell, 2006.126(4): p.663-76.)，通過過表達0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子使細胞從終末分化狀態(tài)變?yōu)楦杉毎麪顟B(tài)。后來又成功利用人成纖維細胞實現(xiàn)了向干細胞的誘導。iPS細胞在形態(tài)、表觀遺傳、功能等方面與ES細胞相似，但卻避免了 ES細胞所要面臨的倫理學問題。
[0006]自從iPS技術(shù)問世后，其成為一個全球的研究熱點。全世界許多實驗室都在逐步利用不同病人來源的體細胞重編程出相應(yīng)的iPS細胞，這類細胞不僅具有相應(yīng)疾病的特征性改變，并且對疾病模型的建立、研究以及藥物篩選等方面具有重要意義。目前已經(jīng)成功建立iPS細胞系的疾病包括高雪氏癥、帕金森病、21三體綜合征(Park，1.H.，et al.，Disease-specific induced pluripotent stem cells.Cell, 2008.134(5): p.877-86.)、擴張型心肌病(Sun, N., et al., Patient-specific induced pluripotent stemcells as a model for familial dilated card1myopathy.Sci Transl Medj 2012.4(130): p.130ra47.)、色素性視網(wǎng)膜炎(Jin，Z.B., et al., Modeling RetinalDegenerat1n Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.Plos One,2011.6(2).)、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(Larribere，L., et al., NFl loss inducessenescence during human melanocyte differentiat1n in an iPSC—based model.Pigment Cell Melanoma Res , 2015.)、白血病(Kurokawa，M.and M.Miyauchi ,[Induced pluripotent stem cells from leukemia patients as a platform fordissecting pathogenesis].Rinsho Ketsueki，2014.55(10): p.2202-7.)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(Lee, J., et al., Generat1n of disease-specific induced pluripotentstem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.Arthritis Research & Therapy, 2014.16(1).)等，在皮膚病相關(guān)疾病中利用病人體細胞重編程出病人iPS細胞的實例較少。
[0007]由于iPS細胞可以來源于多種成體細胞，病人的iPS細胞成為一個研究熱點。利用病人的成體細胞誘導出的iPS細胞具有此類疾病的特點，所以病人iPS細胞在疾病治療、疾病模型建立以及藥物篩選等方面具有重要的意義。通過基因修飾等手段使病人iPS細胞不具有疾病特征，從而誘導分化出相關(guān)的細胞、組織或者器官，進行病人自體移植治療，不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這是iPS細胞與ES細胞相比較的另一個優(yōu)勢。目前已有多種病人的體細胞唄誘導為多功能細胞，而利用白癜風病人的體細胞誘導為多功能干細胞未見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種白癜風病人皮損處成纖維細胞誘導為多功能干細胞的方法。
[0009]本發(fā)明首次提供用白癜風病人皮損處成纖維細胞誘導為多功能干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟:白癜風病人皮損處成纖維細胞的獲取；白癜風病人多功能干細胞的誘導;獲得的白癜風病人誘導多功能干細胞的鑒定。
[0010](I)白癜風病人皮損處成纖維細胞的獲取:
A.取得白癜風病人皮損組織后，在超凈臺取出，用含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)PBS緩沖液洗滌3次，剪碎成Imm3小塊。
[0011]B.滅菌后的蓋玻片蓋于組織塊上，加含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Hycl0ne)37度培養(yǎng)，10至15天可見成纖維細胞出現(xiàn)，2至3天換液。
[0012](2)白癜風病人多功能干細胞的誘導:
A.步驟(I)所得的白癜風病人皮損處成纖維細胞取15細胞量，再加入0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，病毒量分別為400仙，過表達0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc四種轉(zhuǎn)錄因子。
[0013]B.細胞培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)層細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)上，更換誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、5%C02、5%θ2，每天換液，顯微鏡觀察細胞形態(tài)拍照，12天后挑單克隆至新的飼養(yǎng)層細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)上。
[0014]其中誘導培養(yǎng)基成分為ES培養(yǎng)基加維生素C(50mg/ml)，ES培養(yǎng)基包括80% DMEM/F12、20% KSR、1% Non-essential amino acids、lmM L-gIutaMAX > 0.1mM β-mercaptoethanol、5ng/ml bFGFo
[0015]C.用ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)，條件為37°C、5%C02、5%02，每天更換培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。
[0016](3)鑒定白癜風病人誘導多功能干細胞的特征，確定其具有干細胞的特點以及功會K。
[0017]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點
(I)iPS細胞是與ES細胞及其相似的一類誘導多功能干細胞，在表觀遺傳、功能等方面均有很高的相似性，而ES細胞自問世以來卻具有爭議，因為人的ES細胞來源于流產(chǎn)胎兒，不符合倫理學，并且不適合批量生產(chǎn)，對于其應(yīng)用產(chǎn)生了阻礙，但是iPS細胞在來源方面不具備這樣的問題，已經(jīng)有多種細胞建立了 iPS細胞系，包括成纖維細胞、淋巴細胞、肝臟細胞、角質(zhì)細胞，甚至尿液細胞等；
(2)iPS細胞不僅來源廣泛，也可以在利用其過程中避免免疫排斥反應(yīng)，因為人ES細胞畢竟還是同種異體細胞，利用ES細胞來治療疾病的話存在免疫排斥問題，而病人自體的iPS細胞在治療過程中則不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
[0018](3)來自于病人的iPS細胞證實了具有相應(yīng)疾病的特征，通過對病人iPS的研究就可以清楚了解到疾病在某基因方面的缺陷等，有利于疾病的研究。同時也可以利用病人iPS細胞建立相應(yīng)的疾病模型，將其輸入至小鼠體內(nèi)，建立出人源化小鼠疾病模型，可以進行藥物篩選等方面的研究。
[0019](4)病人iPS細胞系的建立成為一個熱點，許多實驗室已經(jīng)建立了多種疾病的iPS細胞系，比如高雪氏癥、帕金森病、21三體綜合征、擴張型心肌病、色素性視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、白血病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。在皮膚病學的研究中，也可以利用這項技術(shù)來研究相關(guān)疾病，但是目前來說實例并不多，并且在色素脫失方面疾病的研究更是稀少。本發(fā)明首次利用白癜風病人皮損處的成纖維細胞誘導出多功能干細胞，對以后白癜風的干細胞治療以及白癜風發(fā)病機制的研究具有重要意義。
【附圖說明】
[0020]圖1.白癜風病人皮損處成纖維細胞形態(tài)觀察圖，圖中標尺大小為ΙΟΟμπι;
圖2.白癜風病人皮損處成纖維細胞誘導為多功能干細胞過程中第4天細胞形態(tài)學觀察Γ4)，箭頭處表示出現(xiàn)的iPS小克隆;2幅圖中標尺大小均為ΙΟΟμπι;
圖3.第二代白癜風病人iPS(VP-1PS)細胞形態(tài)學觀察圖；a: x4;b:xl0;圖a和b中標尺大小均為ΙΟΟμπι;
圖4.VP-1PS細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果;a: x4; b: XlO;圖a和b中標尺大小為ΙΟΟμπι;
圖5.VP-1PS細胞免疫熒光染色檢測干細胞表面標記物的表達結(jié)果;標記物包括0CT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4;
圖6.VP-1PS細胞在干細胞相關(guān)基因的相對表達圖(*:P<