一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋 液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratoiT syndrome, PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratoiT syn化ome virus, PRRSV)引起的，W妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔 和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道癥狀的疾病。PRRS難W有效的防制，首先是PRRSVW 肺巨隧細胞為祀細胞，具有抗體依賴性增強作用（ADE)造成了一定的免疫抑制，其次是 PRRSV不斷的發(fā)生著變異，并且PRRS沒有有效的治療藥物，免疫接種是目前控制該病的最主 要措施。
[0003] 滅活疫苗的主要優(yōu)點是安全，疫苗株不會傳染給其他豬只，同時其毒力也不會返 強。田間試驗研究表明，滅活疫苗的使用不會導(dǎo)致經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的繁殖失敗。目前藍 耳病滅活疫苗主要采用油包水劑型的油乳劑疫苗。油包水型疫苗具有較好的緩釋作用，免 疫后持續(xù)刺激機體達到免疫保護方面表現(xiàn)尤為突出。但油包水劑型的疫苗往往所需較高的 抗原濃度來提高疫苗的效力。為提高PRRS滅活疫苗的效力，需要在確保疫苗病毒株免疫原 性的前提下盡量提高疫苗在滅活前的病毒含量。研究表明，自1996年報道PRRSW來，國內(nèi)許 多學(xué)者先后分離到PRRSV，但各地方分離株的滴度都呈現(xiàn)出較低的狀態(tài)：（1)臺灣分離株，為 美洲型毒株，毒價為l〇 6TCID5〇/0.1ml(臺灣養(yǎng)豬科學(xué)研究所）；（2 乂 H-la、CH-化、CH-lc、CH-Id株，為美洲型毒株，毒價為106TCI化o/O.lml(哈爾濱獸醫(yī)研究所）。因此為了提高病毒含 量，通常的做法是通過濃縮藍耳病抗原十幾倍甚至幾十倍，如此W來不僅增加了生產(chǎn)成本， 同時在濃縮過程中藍耳病病毒的免疫原性會有所降低。
[0004] 本發(fā)明針對上述不足，提出一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，通過該稀釋液 處理豬繁殖與呼吸綜合征病毒后接種細胞，可特異性提高該病毒在祀細胞上的增殖量，可 W提高1-2個病毒滴度即病毒含量提高10-100倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種豬繁殖與呼吸綜合征 病毒稀釋液及其制備方法。
[0006] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于每1000ml憐酸緩沖液中 含有W下重量配比的組分:氨基酸組合10~30g、復(fù)方中藥多糖10~30g和脂質(zhì)體10~30g， 所述的氨基酸組合包括葉酸、核黃素憐酸鋼、右泛醇和抗壞血酸，所述的復(fù)方中藥多糖由獨 活、云香草、蔓荊子、密蒙花、玄參和赤巧提取得到。
[0007] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于該稀釋液的pH為7.0~ 7.5。
[0008] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的憐酸緩沖液由氯 化鋼6~lOg，氯化鐘0.05~0.5g，憐酸氨二鋼1~1.2g，憐酸二氨鐘0.05~0.5g，氯化巧0.05 ~0.2g，含6個結(jié)晶水的氯化儀0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中得到。
[0009] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的每1000ml憐酸緩 沖液中含有W下重量配比的組分:氨基酸組合14~26g、復(fù)方中藥多糖15~25g和脂質(zhì)體12 ~28g〇
[0010] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的氨基酸組合含有 W下重量百分比含量的氨基酸：葉酸20~40%、核黃素憐酸鋼10~40%、右泛醇10~30%和抗 壞血酸30~60%。
[0011] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的脂質(zhì)體按W下步 驟制得:按大豆卵憐脂3重量份和甘氨膽酸1重量份稱取大豆卵憐脂和甘氨膽酸，用氯仿進 行溶解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜;配制pH值為7.0~ 8.0、濃度為O.lm/1的構(gòu)祿酸和構(gòu)祿酸鐘緩沖溶液，將該緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中， 脫水后用勻漿機制備成脂質(zhì)體。
[0012] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖按 W下步驟制得： a、 按獨活5~20份、云香草10~30份、蔓荊子10~30份、密蒙花5~20份、玄參10~30和 赤巧20~40份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化 水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)100(K)rpm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收 集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復(fù)方中藥多糖。
[0013] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，其特征在于所述的步驟a中按獨活 10~15份、云香草15~25份、蔓荊子15~25份、密蒙花10~15份、玄參15~25和赤巧25~35 份稱取各中藥原料。
[0014] 所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液的制備方法，其特征在于包括W下工 藝步驟： 1) 憐酸緩沖溶液的配制： 按氯化鋼6~lOg，氯化鐘0.05~0.5g，憐酸氨二鋼1~1.2g，憐酸二氨鐘0.05~0.5g，氯 化巧0.05~0.2g，含6個結(jié)晶水的氯化儀0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，無菌條件下通過 0.22皿濾膜，過濾除菌備用； 2) 復(fù)方中藥多糖的制備： a、按獨活5~20份、云香草10~30份、蔓荊子10~30份、密蒙花5~20份、玄參10~30和 赤巧20~40份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化 水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)100(K)rpm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收 集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉； 3) 脂質(zhì)體按的制備： 按大豆卵憐脂3重量份和甘氨膽酸1重量份稱取大豆卵憐脂和甘氨膽酸，用氯仿進行溶 解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜;配制pH值為7.0~8.0、 濃度為O.lm/1的構(gòu)祿酸和構(gòu)祿酸鐘緩沖溶液，將該緩沖溶液加入到脂質(zhì)體膜溶液中，脫水 后用勻漿機制備成脂質(zhì)體； 4) 豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液的配制： 按氨基酸組合10~30g、復(fù)方中藥多糖10~30g和脂質(zhì)體10~30g稱取各原料，所述的按 氨基酸組合含有葉酸20~40%、核黃素憐酸鋼10~40%、右泛醇10~30%和抗壞血酸30~60%， 將上述原料溶解于步驟1)制得的憐酸緩沖溶液中，充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5 之間，無菌條件下通過0.22皿濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[001引本發(fā)明的有益效果是： (1)病毒接種后，可促進細胞生長，保持細胞正常生長。
[0016] (2)處理后病毒更容易感染細胞，大幅提高病毒感染細胞幾率。
[0017] (3)相同培養(yǎng)時間可W大幅提高病毒滴度，病毒含量提高10-100倍。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 運些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液中含有:氨 基酸組合20g(葉酸4g、核黃素憐酸鋼6g、右泛醇4g、抗壞血酸6g)、復(fù)方中藥多糖20g和脂質(zhì) 體20g，該稀釋液pH為7.2。
[0020] -種豬繁殖與呼吸綜合征病毒稀釋液的制備方法，其步驟是： (1)憐酸緩沖溶液的配制:按上述憐酸鹽緩沖液配方準確稱取氯化鋼8g，氯化鐘0.2g， 憐酸氨二鋼1.15g，憐酸二氨鐘0.2g，氯化巧0.1 g，含6個結(jié)晶水的氯化儀0.1 g溶于1000ml雙 蒸水中，無菌條件下通過0.22皿濾膜，過濾除菌備用。
[0021] (2)復(fù)方中藥多糖的制備 a、按獨活5份、云香草30份、蔓荊子20份、密蒙花20份、玄參20和赤巧20份稱取所述中藥 原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在 90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次。
[0022] b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清。
[0023] c、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解， 溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收 集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復(fù)方中藥多糖。
[0024] (3)脂質(zhì)體制備 按大豆卵憐脂3重量份和甘氨膽酸1重量份稱取大豆卵憐脂和甘氨膽酸，用氯仿進行溶 解，并使其混合均勻，并通過減壓法去除溶液中氯仿，制備脂質(zhì)體膜;配制pH值為7.0~8.0、 濃度為O.lm/1的構(gòu)祿酸和構(gòu)祿酸鐘緩沖溶液，將該緩沖