一種甾醇內(nèi)酰胺化合物馬勃內(nèi)酰胺及其在制備抗補(bǔ)體藥物中的用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及一種甾醇內(nèi)酰胺化合物及其在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。本發(fā)明從馬勃的子實(shí)體中分離得到甾醇內(nèi)酰胺化合物馬勃內(nèi)酰胺，該化合物為B環(huán)內(nèi)酰胺的麥角甾醇，經(jīng)抗補(bǔ)體活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)所述的甾醇內(nèi)酰胺化合物馬勃內(nèi)酰胺其對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑激活均有較強(qiáng)的抑制作用，其CH50值為0.032±0.007mg/ml，AP50值為0.067±0.009mg/ml。所述化合物可用于制備補(bǔ)體抑制劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種甾醇內(nèi)酰胺化合物馬勃內(nèi)酰胺及其在制備抗補(bǔ)體藥物 中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及一種留醇內(nèi)酰胺新化合物馬勃內(nèi)酰胺及其在制備抗 補(bǔ)體藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活會(huì)引發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎（RA)、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)等多種重大疾病。抗補(bǔ)體藥物研究多年來(lái)一直是世 界藥學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。然而目前對(duì)此類(lèi)疾病尚缺乏較為理想的治療藥物，因此臨床上 急需高效、低毒、專(zhuān)一的新型補(bǔ)體抑制劑。從天然產(chǎn)物中研究開(kāi)發(fā)補(bǔ)體抑制劑是近年來(lái)一個(gè) 受到越來(lái)越多關(guān)注的重要研究領(lǐng)域，其具有成本低、毒性低等特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從包括海 洋生物在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物中分離得到多種具有補(bǔ)體系統(tǒng)抑制作用的單體化合物，為抗補(bǔ) 體藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供了廣闊的前景。
[0003] 馬勃又名馬灰包、灰包子等，是一種常見(jiàn)的以藥用為主的大型真菌，具有消腫、 止血、清肺、利咽、解毒等作用。2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，馬勃為灰包科真菌脫皮馬勃 (Lasiosphaerafenzlii Reich.)、大馬勃（Calvatiagigantea(Batsch ex Pers. ) Lloyd)或 紫色馬勃（Calvatia lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd)的干燥子實(shí)體。研究表明的已有的 化學(xué)成分中主要活性成分為留醇，此外還含有萜類(lèi)、脂肪酸及其酯、氨基酸、多糖等，具有抗 菌、抗炎、止咳、抗腫瘤、抑制自由基等藥理活性。
[0004] 本申請(qǐng)的發(fā)明擬提供一種從馬勃中分離得到留醇內(nèi)酰胺新化合物，命名為馬勃內(nèi) 酰胺，該化合物結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，為B環(huán)內(nèi)酰胺的麥角留醇結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和生物活性均未見(jiàn)報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種留醇內(nèi)酰胺化合物馬勃內(nèi)酰胺及其在制備抗補(bǔ)體藥物 中的用途。
[0006] 本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理研究方法，從馬勃子實(shí)體的乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位中 分離得到一種留醇內(nèi)酰胺新化合物馬勃內(nèi)酰胺，并對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行抗補(bǔ)體活 性評(píng)價(jià)，結(jié)果證實(shí)其對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑激活均有較強(qiáng)的抑制作用。
[0007] 本發(fā)明所述的馬勃內(nèi)酰胺具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0008]
[0009] 本發(fā)明所述的化合物通過(guò)下述方法制備：
[0010] 取馬勃原料粉碎，乙醇回流提取，合并提取液并濃縮得浸膏，加水混懸，分別以等 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液并濃縮至干，乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜 分離、Sephadex LH-20柱色譜和反相HPLC等手段純化，分離得到化合物馬勃內(nèi)酰胺。
[0011] 所述化合物馬勃內(nèi)酰胺：白色粉末，分子式C2SH41N02, EI-MS m/z: 423 [M]+。 ^-NMR (400MHz, CDC13) δ Η： 7. 45 (1Η, s, ΝΗ), 5. 76 (1Η, s), 5. 57 (1Η, s), 5. 25 (1Η, d d, J = 15. 2Hz, 7. 4Hz), 5. 18 (1Η, dd, J = 15. 2Hz, 8. 3Hz), 1. 30 (3Η, s), 1. 04 (3Η ,d，J = 6·6Ηζ), 0.94 (3H,d,J = 6·8Ηζ), 0.85 (6H,d,J = 6·6Ηζ), 0,66 (3H,s)。 13C-NMR(100MHz, CDC13) δ c:35. 2(C-1)，33· 0(C-2)，198. 0(C-3)，115. 1 (C-4)，161. 6(C-5)， 166. 7(C-6)，119. 0(C-7)，156. 5(C-8)，46. 2(C-9)，40. 4(C-10)，23. 4(C-11)，39. 2(C-12)， 45. 9 (C-13)，58. 2 (C-14)，25. 8 (C-15)，33. 0 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C-18)，22. 2 (C-19)， 40. 4 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 8 (C-22)，132. 7 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)， 19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0012] 本發(fā)明制得的馬勃內(nèi)酰胺進(jìn)行了體外抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗(yàn)和體外抗補(bǔ)體旁路途 徑試驗(yàn)，經(jīng)體外抗補(bǔ)體活性試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果表明其對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑和旁路途徑激活 均有較強(qiáng)的抑制作用，其CH 5。和AP5。值分別為0· 032±0· 007mg/ml、0. 067±0· 012mg/ml。陽(yáng) 性對(duì)照肝素 CH5。和AP 5。值分別為0. 026±0. 005mg/ml、0. 054±0. 016mg/ml。所述的馬勃內(nèi) 酰胺可用于制備補(bǔ)體抑制劑。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是馬勃中馬勃內(nèi)酰胺的提取分離流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1制備馬勃內(nèi)酰胺
[0015] 取藥材馬勃子實(shí)體25kg，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h， 合并提取液并濃縮得浸膏〇.85kg，加水（4L)混懸，分別以以等體積石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物160g;將乙酸乙酯萃取 部位經(jīng)硅膠（200-300目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫， 得到10個(gè)流份（Fr. 1-10)，其中流份Fr.6(14g)再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1，10:1,5:1,3:1)、S印hadex LH-20 柱色譜（氯仿-甲醇，1:1)和 HPLC(甲醇-水， 20:80-80:20,梯度洗脫）等手段純化，分離得到化合物馬勃內(nèi)酰胺；
[0016] 所述化合物馬勃內(nèi)酰胺：白色粉末，分子式C2SH41N0 2, EI-MS m/z: 423 [M]+。 ^-NMR (400MHz, CDC13) δ Η： 7. 45 (1Η, s, ΝΗ), 5. 76 (1Η, s), 5. 57 (1Η, s), 5. 25 (1Η, d d, J = 15. 2Hz, 7. 4Ηζ), 5. 18 (1Η, dd, J = 15. 2Hz, 8. 3Ηζ), 1. 30 (3Η, s), 1. 04 (3Η ,d，J = 6·6Ηζ), 0.94 (3H,d,J = 6·8Ηζ), 0.85 (6H,d,J = 6·6Ηζ), 0,66 (3H,s)。 13C-NMR(100MHz, CDC13) δ c:35. 2(C-1)，33· 0(C-2)，198. 0(C-3)，115. 1 (C-4)，161. 6(C-5)， 166. 7(C-6)，119. 0(C-7)，156. 5(C-8)，46. 2(C-9)，40. 4(C-10)，23. 4(C-11)，39. 2(C-12)， 45. 9 (C-13)，58. 2 (C-14)，25. 8 (C-15)，33. 0 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C-18)，22. 2 (C-19)， 40. 4 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 8 (C-22)，132. 7 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)， 19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0017] 實(shí)施例2體外抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗(yàn)
[0018] 取補(bǔ)體（豚鼠血清）0. 04ml，加入巴比妥緩沖液（BBS)配制成1:10的溶液，用BBS 對(duì)倍稀釋成 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640 和 1:1280 的溶液；取 1:1000 溶血素、2% 羊紅細(xì)胞（SRBC)各0. lml及各濃度補(bǔ)體0. 2ml溶于0. 2ml BBS中，混勻，37°C水浴30min 后放入低溫高速離心機(jī)，在4000rpm、4°C條件下離心5min。分別取每管上清0. 2ml于96孔 板，在405nm測(cè)定其吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組（0. lml 2% SRBC、0. lml溶血素溶于 0. 4ml三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率。以補(bǔ)體稀釋度為 X軸，溶血百分率為Y軸作圖，選擇達(dá)到相似高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常 溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度，取臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按上述方法于405nm下測(cè)定 吸光度，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組，將供試品吸光度值扣除相應(yīng)供試 品對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血率，以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計(jì)算 50%抑制溶血所需供試品的濃度（CHJ，結(jié)果為0. 032±0. 007mg/ml，陽(yáng)性對(duì)照肝素015。值 為 0· 026±0· 005mg/ml。
[0019] 實(shí)施例3體外抗補(bǔ)體旁路途徑試驗(yàn)
[0020] 取補(bǔ)體（人血清）0.2ml，加入AP稀釋液（巴比妥緩沖液，pH = 7.4,含5mM Mg2+，8mM EGTA)配制成 1:5 的溶液，并對(duì)倍稀釋成 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 和 1:640的溶液；取各濃度補(bǔ)體0. 15ml、AP稀釋液0. 15ml及0. 5 %兔紅細(xì)胞（RE)0. 20ml，混 勾，37°C水浴30min后置于低溫高速離心機(jī)，在4000rpm、4°C條件下離心5min。分別取每管 上清0. 2ml于96孔板，在405nm測(cè)定吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組（0. 20ml 0. 5 % RE溶 于0. 3ml三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率，以補(bǔ)體稀釋度 為X軸，溶血百分率為Y軸作圖；選擇達(dá)到相似高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正 常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度，取確定的臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按上述方法于405nm 下測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組，將供試品吸光度值扣除 相應(yīng)供試品對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血率，以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作 圖，計(jì)算50%抑制溶血所需供試品的濃度（APJ，結(jié)果為0. 067±0. 009mg/ml，陽(yáng)性對(duì)照肝 素 AP5。值為 0· 054±0· 016mg/ml。
[0021 ] 本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)采用的試劑均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 下式結(jié)構(gòu)的醬醇內(nèi)酷胺化合物馬勃內(nèi)酷胺，2. 按權(quán)利要求1所述的醬醇內(nèi)酷胺化合物馬勃內(nèi)酷胺，其特征在于，通過(guò)下述方法制 備： 取藥材馬勃子實(shí)體，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次化，合并提取液并濃縮得浸 膏，加水混懸，分別W等體積石油酸、乙酸乙醋和正下醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干， 得乙酸乙醋萃取物；將乙酸乙醋萃取部位經(jīng)硅膠200-300目，柱色譜分離，依次W二氯甲 燒-甲醇其中50:1-0:1，梯度洗脫，得到10個(gè)流份（化.1-10)，其中流份化.6再經(jīng)硅膠柱色 譜其中，二氯甲燒-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3: USe地adex LH-20柱色譜其中，氯仿-甲 醇，1:1和HPLC其中，甲醇-水，20:80-80:20，梯度洗脫、純化，分離得到化合物馬勃內(nèi)酷胺。3. 權(quán)利要求1所述的醬醇內(nèi)酷胺化合物馬勃內(nèi)酷胺在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。4. 按權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的醬醇內(nèi)酷胺化合物馬勃內(nèi)酷胺對(duì)補(bǔ) 體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑抑制。5. 按權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的醬醇內(nèi)酷胺化合物馬勃內(nèi)酷胺對(duì)補(bǔ) 體系統(tǒng)的旁路途徑激活抑制。
【文檔編號(hào)】A61P37/02GK105985402SQ201510052295
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月1日
【發(fā)明人】陳道峰, 范明松, 黃成鋼
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)