sgow MEM培養(yǎng)基，改良的MEM鋅選項培養(yǎng)基，頂DM培養(yǎng)基，Medium 199培養(yǎng)基，Eagle MEM培養(yǎng)基，αΜΕΜ培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，ham培養(yǎng)基，Ham’s F-12培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基，F(xiàn)ischer’s培養(yǎng)基，其混合的培養(yǎng)基等。
[0102]為了避免對多能干細胞向眼前段組織或其部分結構或其前體組織的分化誘導的不利影響，用于聚集體形成的培養(yǎng)基優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基。所述無血清培養(yǎng)基意指不含未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。含有純化的來源于血液的成分和來源于動物組織的成分(例如，細胞因子)的培養(yǎng)基對應于無血清培養(yǎng)基。
[0103]用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是適當?shù)匕宓鞍?、運鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前體、痕量元素、2-巰基乙醇或3’-硫代甘油或其等價物等的替代品。例如，這樣的血清替代品可以通過W098/30679所述的方法制備。為了促使本發(fā)明的方法更容易實施，可以使用商購的血清替代品。所述商購血清替代品的實例包括敲除血清替代物(Knockout Serum Replacement ,KSR,由Invitrogen制備)，化學成分確定的濃縮脂質(Chemically-defined Lipid Concentrated，由Gibco Company制備)和Glutamax(由Gibco Company制備)。
[0104]用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以包含其他添加劑，只要對多能干細胞向眼前段組織或其部分結構或其前體組織的分化誘導沒有不利影響即可。添加劑的實例包括，但不限于，胰島素、鐵源(例如，運鐵蛋白等)、礦物質(例如，砸酸鈉等)、糖(例如，葡萄糖等)、有機酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺等)、還原劑(例如，2-巰基乙醇等)、維生素(例如，抗壞血酸、d-生物素等)、抗生素(例如，鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如，HEPES等)等。
[0105]用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以是下文提到的用于誘導多能干細胞向眼前段組織或其部分結構或其前體組織分化的培養(yǎng)基。
[0106]為了形成多能干細胞聚集體，自傳代培養(yǎng)物收集多能干細胞，并且分散成單個細胞狀態(tài)或接近單個細胞狀態(tài)。將多能干細胞用適當?shù)募毎x散溶液分散。所述細胞離散溶液的實例包括EDTA;蛋白酶如胰蛋白酶、膠原酶IV、金屬蛋白酶等，等等，它們被單獨使用或者以適當?shù)慕M合使用。這些中，優(yōu)選的是顯示低細胞毒性的那種，并且此種細胞離散溶液的實例包括商購的產(chǎn)品如DISPASE(EIDIA)，TrypLE(Invitrogen) ,Accutase(MILLIPORE)等。其中，優(yōu)選使用Accutase，因為其甚至在細胞被解離成接近單個細胞狀態(tài)時也不容易引起多能干細胞(特別是人多能干細胞)的細胞死亡。分散的多能干細胞被懸浮在上述培養(yǎng)基中。
[0107]為了抑制由分散引起的多能干細胞(特別是人多能干細胞)的細胞死亡，優(yōu)選的是自培育開始起就加入Rho相關卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil kinase ,ROCK)的抑制劑(見^-2008-99662)。如0(抑制劑的實例包括￥-27632(( + )-(10-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽)等。用于懸浮培養(yǎng)的ROCK抑制劑的濃度是能夠抑制由分散引起的多能干細胞的細胞死亡的濃度。例如，對于Y-27632，該濃度通常約為
0.1-200μΜ，優(yōu)選地約2-50μΜ。
[0108]將分散的多能干細胞的懸浮液接種到上述培養(yǎng)容器中，并且將分散的多能干細胞在不粘附細胞培養(yǎng)容器的條件下培養(yǎng)，由此多個多能干細胞組裝形成聚集體。在該情形中，分散的多能干細胞可以被接種到比較大的培養(yǎng)容器(如10-cm平皿)中，以在一個培養(yǎng)隔室中同時形成多個多能干細胞聚集體。然而，聚集體的尺寸，以及其中包含的多能干細胞的數(shù)量可以寬泛地變化，并且所述變化可能引起聚集體之間多能干細胞向眼前段組織或其部分結構或其前體組織的分化水平的差異，這又可能降低分化誘導的效率。因此，優(yōu)選的是快速地使分散的多能干細胞成一體以在一個培養(yǎng)隔室中形成一個聚集體。用于快速地使分散的多能干細胞成一體的方法的實例包括下述方法:
[0109](I)包括將分散的多能干細胞裝入具有比較小的體積(例如，不大于lml，不大于500μ1，不大于200μ1，不大于ΙΟΟμΙ)的培養(yǎng)隔室中以在所述隔室中形成一個聚集體的方法。優(yōu)選地，在裝入所述分散的多能干細胞后，將所述培養(yǎng)隔室靜置。所述培養(yǎng)隔室的實例包括，但不限于，多孔板(384-孔，192-孔，96-孔，48-孔，24-孔等)中的孔，微孔，室載玻片等，管，懸滴法中的培養(yǎng)基的液滴等。由于重力，裝在所述隔室中的分散的多能干細胞沉淀于一點上，或者細胞彼此粘附從而在一個培養(yǎng)隔室中形成一個聚集體。多壁板、微孔、室載玻片、管等的底部的形狀優(yōu)選是U型底或V型底，以促使分散的多能干細胞沉淀于一點。
[0110](2)包括將分散的多能干細胞放置在離心管中，將其離心以允許多能干細胞沉淀于一點上，由此在管中形成一個聚集體的方法。
[0111]要接種在一個培養(yǎng)隔室中的多能干細胞的數(shù)量沒有特別的限制，只要每個培養(yǎng)隔室形成一個聚集體，并且可以通過本發(fā)明的方法在所述聚集體中誘導多能干細胞向眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的分化。通常，在一個培養(yǎng)隔室中接種約I X 13-約5X 14個，優(yōu)選約I X 13-約2 X 14個，更優(yōu)選約2 X 13-約1.2 X 14個多能干細胞。然后，通過快速地使多能干細胞成一體，每個培養(yǎng)隔室形成通常由約I X 13-約5 X 14個、優(yōu)選約I X 13-約2 X 14個、更優(yōu)選約2 X 13-約1.2 X 14個多能干細胞構成的一個細胞聚集體。
[0112]可以適當?shù)卮_定聚集體形成所需的時間，只要每個隔室形成一個聚集體，并且可以通過本發(fā)明的方法在所述聚集體中誘導多能干細胞向眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的分化。通過縮短所述時間，預期向目標眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的分化的有效誘導，并且，因此，所述時間優(yōu)選更短。優(yōu)選地，在24小時內(nèi)形成多能干細胞聚集體，更優(yōu)選地，在12小時內(nèi)形成，更優(yōu)選地在6小時內(nèi)形成，最優(yōu)選地在2- 3小時內(nèi)形成。可以通過由本領域技術人員選擇用于細胞聚集的工具、離心條件等來適當?shù)卣{(diào)節(jié)聚集體形成所需的時間。
[0113]可以適當?shù)卦O定其他培養(yǎng)條件，如聚集體形成時的培養(yǎng)溫度和CO2濃度。培養(yǎng)溫度沒有特別限制，并且，例如，是約30-40°C，優(yōu)選地約37°C。例如，CO2濃度是約1-1 O %，優(yōu)選約
[0114]此外，準備多個在相同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)隔室，并且在每個培養(yǎng)隔室中形成一個多能干細胞聚集體，由此可以獲得多能干細胞聚集體的質量均一的群體。多能干細胞聚集體是否是質量均一的可以基于下述進行評價:聚集體團塊的尺寸和其中的細胞數(shù)量，通過組織染色分析的其宏觀形態(tài)學、微觀形態(tài)學和同質性，分化和不分化標記物的表達及其同質性，分化標記物表達的調(diào)節(jié)及其同步性，聚集體間分化效率的重現(xiàn)性等。在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的多能干細胞聚集體的群體在所述聚集體中包含均一數(shù)量的多能干細胞。特定參數(shù)“均一”的多能干細胞聚集體的群體意指在其群體中的總聚集體的不低于90%落在所述聚集體群體中該參數(shù)的平均數(shù)±10%、優(yōu)選±5%的范圍內(nèi)。
[0115](4)眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的誘導
[0116]本發(fā)明的制備方法包括在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質如BMP4存在下懸浮培養(yǎng)多能干細胞聚集體。通過在包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)多能干細胞聚集體，誘導自所述多能干細胞向眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的分化，并且產(chǎn)生包含眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的細胞聚集體。
[0117]按照本發(fā)明，通過在懸浮培養(yǎng)條件下用骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質如BMP4處理多能干細胞聚集體而誘導眼前段組織的自組織，由此可以立體形成眼前段組織(如角膜、晶狀體等)、其部分結構或其前體組織。按照本發(fā)明的一個實施方案，通過懸浮培養(yǎng)多能干細胞聚集體而誘導神經(jīng)視網(wǎng)膜的自組織。在該過程中，通過用骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質處理，表面外胚層以自組織的方式形成在所述聚集體中形成的視網(wǎng)膜上皮組織聚集體的表面中，并且，可以在體外自發(fā)引起“視網(wǎng)膜誘導眼前段組織的前體組織(晶狀體基板、角膜基板等)自表面外胚層分化”，這是在體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中可見的。結果，神經(jīng)視網(wǎng)膜在細胞聚集體內(nèi)自組織，并且眼前段組織、其部分結構或其前體組織(例如，晶狀體基板、角膜上皮前體組織)在其表面上自組織。即，在一個實施方案中，通過本發(fā)明獲得的細胞聚集體還包含神經(jīng)視網(wǎng)膜組織。以這種方式獲得細胞聚集體，所述細胞聚集體包含構成所述細胞聚集體的表層的眼前段組織或其部分結構、或其前體組織和在所述細胞聚集體內(nèi)部的神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，其中所述眼前段組織或其部分結構、或其前體組織與所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織相鄰。
[0118]“懸浮培養(yǎng)”多能干細胞聚集體是指在不粘附培養(yǎng)容器的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細胞的聚集體。這使得在常規(guī)貼壁培養(yǎng)中難以實現(xiàn)的立體形成成為可能。
[0119]用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質。所述骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質是激活該途徑的任意物質，在骨形態(tài)發(fā)生因子與受體結合后，信號通過該途徑傳遞。所述骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質的實例包括BMP2，BMP4，BMP7，⑶F5等。優(yōu)選地，所述骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質是BMP4。盡管以下主要描述BMP4，但是，用于本發(fā)明的骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質不限于BMP4。BMP4是已知的細胞因子，其氨基酸序列也是已知的。用于本發(fā)明的BMP4是哺乳動物BMP4。哺乳動物的實例包括實驗動物如嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等，兔等;家養(yǎng)動物如豬、牛、山羊、馬、綿羊等；陪伴動物，如狗、貓等；和靈長類動物如人、猴、猩猩、黑猩猩等。BMP4優(yōu)選是嚙齒動物(小鼠，大鼠等)或靈長類動物(人等)的BMP4，最優(yōu)選是人BMP4。人BMP4意指BMP4具有在人體中天然表達的BMP4的氨基酸序列。代表性的人BMP4的氨基酸序列的實例包括NCBI登記號ΝΡ_001193.2(2013年6月15日更新)，ΝΡ_570911.2(2013年6月15日更新)，ΝΡ_570912.2(2013年6月15日更新)，通過從這些氨基酸序列中的每個去除N端信號序列(1-24)獲得的氨基酸序列(成熟形式的人ΒΜΡ4氨基酸序列)等。
[0120]骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質在培養(yǎng)基中的濃度可以適當?shù)卮_定在這樣的范圍內(nèi)，在所述范圍內(nèi)，可以在聚集體中誘導多能干細胞向眼前段組織或其部分結構、或其前體組織的分化。當使用ΒΜΡ4作為骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質時，其濃度通常為0.1-50ηΜ，優(yōu)選1-5ηΜ。在培養(yǎng)期間ΒΜΡ4濃度可以保持恒定或者變化。例如，可以先將ΒΜΡ4濃度設定為3- 7ηΜ，優(yōu)選4_6ηΜ，更優(yōu)選約5ηΜ，然后設定為0_3ηΜ，優(yōu)選0.5_2ηΜ，更優(yōu)選約 InM0
[0121]不需要在自多能干細胞誘導眼前段組織或其部分結構或其前體所需的整個時間期間一直進行在包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質(ΒΜΡ4等)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，僅需要在部分時間期間進行。例如，先將多能干細胞聚集體在不存在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質(ΒΜΡ4等)的條件下進行懸浮培養(yǎng)，之后在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質(ΒΜΡ4等)存在下對其進行懸浮培養(yǎng)。在一個實施方案中，在形成多能干細胞聚集體之后，將所述多能干細胞聚集體在不存在骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質(ΒΜΡ4等)的條件下懸浮培養(yǎng)1-5天，優(yōu)選1-3天，然后，可以在將培養(yǎng)基更換為包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號轉導途徑激活物質(ΒΜΡ4等)的培養(yǎng)基后繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。
[0122]用于聚集體的懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以使用用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基來制備。所述基礎培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其可以用于培養(yǎng)動物細胞即可，并且可以是BME培養(yǎng)基，BGJb培養(yǎng)基，CM