法的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)完全或部分地在存在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件下進(jìn)行。作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以使用具有使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的活性的任意物質(zhì)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括bFGF。盡管在下文中主要描述了bFGF，但是本發(fā)明中所用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子不限于bFGF。加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF等)促進(jìn)角膜上皮的分層。
[0146]bFGF是已知的細(xì)胞因子，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本發(fā)明的bFGF是哺乳動(dòng)物bFGF。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物，包括小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等，兔等;家養(yǎng)動(dòng)物，如豬、牛、山羊、馬、綿羊等;陪伴動(dòng)物，如狗、貓等;和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如人、猴、猩猩、黑猩猩等。bFGF優(yōu)選是嚙齒動(dòng)物(小鼠，大鼠等)或靈長(zhǎng)類動(dòng)物(人等)的bFGF，最優(yōu)選是人bFGF。人bFGF的代表性氨基酸序列的實(shí)例包括NCBI登記號(hào)NP_001997.5(2013年7月7日更親萬)等。
[0147]當(dāng)使用bFGF作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子時(shí)，bFGF在用于角膜上皮分層的培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限制，只要其促進(jìn)角膜上皮的分層即可。然而，其通常為約0.1-1000ng/ml，優(yōu)選約0.5-500ng/ml，更優(yōu)選約2_200ng/ml。
[0148](9)間充質(zhì)組織的誘導(dǎo)
[0149]在包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(BMP4等)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)在上述(6)或(7)中獲得的包含角膜上皮或其前體組織以及神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體(其中所述角膜上皮或其前體組織構(gòu)成所述細(xì)胞聚集體的表層，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織被包含在所述細(xì)胞聚集體的內(nèi)部，并且所述角膜上皮或其前體組織與所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織鄰接)，由此在所述角膜上皮或其前體組織與所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織之間形成間充質(zhì)組織。所述間充質(zhì)組織表現(xiàn)出層形態(tài)，其中間充質(zhì)細(xì)胞密實(shí)地聚集。已知成人角膜從表面到內(nèi)部包含三層:上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮，并且基質(zhì)和內(nèi)皮是由間充質(zhì)細(xì)胞而不是表面外胚層發(fā)育而來。即，本發(fā)明可以在細(xì)胞聚集體中重現(xiàn)體內(nèi)胚胎內(nèi)的角膜基質(zhì)和角膜內(nèi)皮的發(fā)育。按照進(jìn)一步培養(yǎng)的結(jié)果，所得到的細(xì)胞聚集體包含角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織，間充質(zhì)組織，和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，其中所述角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、間充質(zhì)組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織從所述細(xì)胞聚集體表層到內(nèi)部以角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、間充質(zhì)組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的次序按層排列。
[0150]在一個(gè)實(shí)施方案中，在角膜上皮或其前體組織與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織之間形成的間充質(zhì)組織可以是角膜基質(zhì)或其前體組織和角膜內(nèi)皮或其前體組織。在該實(shí)施方案中，由進(jìn)一步培養(yǎng)獲得的細(xì)胞聚集體包含角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、角膜基質(zhì)或其前體組織、角膜內(nèi)皮或其前體組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，其中這些從所述細(xì)胞聚集體表層到內(nèi)部以角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、角膜基質(zhì)或其前體組織、角膜內(nèi)皮或其前體組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的次序按層排列。即，在所述細(xì)胞聚集體中，鄰近神經(jīng)視網(wǎng)膜組織并且在其外部形成包含角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、角膜基質(zhì)或其前體組織和角膜內(nèi)皮或其前體組織的角膜或其前體組織(角膜樣組織)。
[0151]間充質(zhì)組織或角膜基質(zhì)或其前體組織以及角膜內(nèi)皮或其前體組織的誘導(dǎo)可以使用角膜基質(zhì)、角膜內(nèi)皮或其前體組織的標(biāo)記物(包括H)GFR-a，Pi tx2，ABCG2等)的表達(dá)或形態(tài)特征(形成間充質(zhì)細(xì)胞在其中密實(shí)地聚集的層)作為指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，由于角膜內(nèi)皮具有如上皮化內(nèi)皮細(xì)胞層的形態(tài)，所以可能通過使用此種形態(tài)特征作為指標(biāo)來區(qū)分角膜基質(zhì)(或其前體組織)與角膜內(nèi)皮(或其前體組織)或者證實(shí)角膜內(nèi)皮或其前體組織的誘導(dǎo)。
[0152]誘導(dǎo)間充質(zhì)組織(角膜基質(zhì)或其前體組織，以及角膜內(nèi)皮或其前體組織)所需要的時(shí)間取決于培養(yǎng)條件和所述多能干細(xì)胞所來源的哺乳動(dòng)物種類而變化，并且不能一般性指定。然而，當(dāng)使用人多能干細(xì)胞時(shí)，間充質(zhì)組織(角膜基質(zhì)或其前體組織，以及角膜內(nèi)皮或其前體組織)在例如自開始懸浮培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞聚集體起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天內(nèi)在角膜上皮或其前體組織與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織之間形成。通過選擇證實(shí)已經(jīng)形成間充質(zhì)組織(角膜基質(zhì)或其前體組織，以及角膜內(nèi)皮或其前體組織)的細(xì)胞聚集體，在上述實(shí)施方案中，可以獲得包含角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)或其前體組織、間充質(zhì)組織(角膜基質(zhì)或其前體組織，以及角膜內(nèi)皮或其前體組織)和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體。
[0153]作為用于進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)以誘導(dǎo)間充質(zhì)組織的培養(yǎng)基，可以繼續(xù)使用上述(4)中所述的用于懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)基。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以采用被改良以適于培養(yǎng)角膜上皮和表皮上皮的細(xì)胞的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基的實(shí)例包括，但不限于，CnT-30培養(yǎng)基(由CELLnTEC制備)，成分確定的K-SFM培養(yǎng)基(由Gibco/Invitrogen制備)等。
[0154]當(dāng)需要形成上述實(shí)施方案中的包含分層的角膜上皮、間充質(zhì)組織(角膜基質(zhì)或其前體組織，以及角膜內(nèi)皮或其前體組織)和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體時(shí)，用于進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF等)。
[0155]當(dāng)使用bFGF作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子時(shí)，bFGF在用于進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限制，只要其促進(jìn)角膜上皮的分層即可。然而，其通常為約0.1-1000ng/ml，優(yōu)選約0.5- 500ng/ml，更優(yōu)選約2- 200ng/ml。
[0156](1)晶狀體泡的誘導(dǎo)
[0157]在包含骨形態(tài)發(fā)生因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(BMP4等)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)在上述(6)中獲得的包含晶狀體基板和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體(其中所述晶狀體基板構(gòu)成所述細(xì)胞聚集體的表層，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織被包含在所述細(xì)胞聚集體的內(nèi)部，并且所述晶狀體基板鄰接所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織)，由此誘導(dǎo)晶狀體基板的內(nèi)陷，并且形成晶狀體泡。結(jié)果，可以形成包含晶狀體泡和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體。晶狀體泡的形成可以使用作為晶狀體前體組織標(biāo)記物(例如，L-Maf)陽性的囊泡的形態(tài)特征作為指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。形成晶狀體泡所需要的時(shí)間取決于培養(yǎng)條件和所述多能干細(xì)胞所來源的哺乳動(dòng)物種類而變化，并且不能一般性指定。然而，當(dāng)使用人多能干細(xì)胞時(shí)，晶狀體泡在例如自開始懸浮培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞聚集體起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天內(nèi)形成。通過選擇證實(shí)已經(jīng)由培養(yǎng)的多個(gè)細(xì)胞聚集體形成晶狀體泡的細(xì)胞聚集體，可以獲得包含晶狀體泡和細(xì)胞聚集體神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體。
[0158]作為用于進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用添加有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的上述
(4)中所述的用于懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)基。即，在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)完全或部分地在存在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件下進(jìn)行。作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以使用具有使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的活性的任意物質(zhì)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括bFGF。盡管在下文中主要描述了bFGF，但是本發(fā)明中所用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子不限于bFGF。通過加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF等)，形成的晶狀體泡開始表現(xiàn)出與在體內(nèi)晶狀體發(fā)育中觀察到的形態(tài)極性一致的形態(tài)極性，即，其在前-后軸之前的部分是薄的，并且在前-后軸之后的部分是厚的。盡管通過繼續(xù)使用未添加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF等)的上述(4)中所述的用于浮游培養(yǎng)多能干細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)基也可以誘導(dǎo)晶狀體基板的內(nèi)陷和晶狀體泡的形成，但是沒有清楚地出現(xiàn)上述組織極性。
[0159]當(dāng)使用bFGF作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子時(shí)，bFGF在用于誘導(dǎo)晶狀體泡形成的培養(yǎng)基中的濃度沒有特別限制，只要其能夠給予晶狀體泡前述形態(tài)極性即可。然而，其通常為約
0.l-1000ng/ml，優(yōu)選約0.5-500ng/ml，更優(yōu)選約2_200ng/ml。
[0160](11)制備眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織
[0161]在另一方面，可以從如上文提及獲得的細(xì)胞聚集體分離眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織可以與神經(jīng)視網(wǎng)膜組織一起分離。此外，本發(fā)明提供通過上述方法獲得的細(xì)胞聚集體、眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織。例如，可以從包含角膜或其前體組織和神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體(其中所述角膜或其前體組織構(gòu)成所述細(xì)胞聚集體的表層，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織被包含在所述細(xì)胞聚集體的內(nèi)部，并且所述角膜或其前體組織鄰接所述神經(jīng)視網(wǎng)膜組織)分離包含角膜或其前體組織的表層。在上述(8)中獲得的細(xì)胞聚集體中，由于所述角膜或其前體組織在所述聚集體的表層形成可手工分離的層，所以所述角膜或其前體組織能夠被容易地分離，而無需酶處理等。此外，通過用酶等分散所獲得的角膜或其前體組織，甚至在不使用FACS等的情況下也可以以高純度分離角膜細(xì)胞和角膜祖細(xì)胞。這樣獲得的角膜或其前體組織可以用于按其原樣或以培養(yǎng)物薄片的形式移植。
[0162]以這種方式，通過本發(fā)明獲得的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織可以用于移植。例如，通過本發(fā)明獲得的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織可以用作治療藥物用于由眼前段組織的病癥導(dǎo)致的疾病，或用于損傷的眼前段組織的補(bǔ)充組織。通過向具有由眼前段組織的病癥導(dǎo)致的疾病或受損的眼前段組織的患者移植通過本發(fā)明獲得的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織，所述由眼前段組織的病癥導(dǎo)致的疾病或?qū)ρ矍岸谓M織的損傷可以得到治療。由眼前段組織的病癥導(dǎo)致的疾病的實(shí)例包括由角膜病癥導(dǎo)致的疾病(圓錐角膜，大泡性角膜病變(bullous keratopathy)，角膜白斑(corneal leukoma)，皰疹角膜(herpescornea)，角膜營(yíng)養(yǎng)不良(corneal dystrophy)，由近視激光手術(shù)(如L A S E K、P R K等)失敗導(dǎo)致的角膜損傷)，由晶狀體病癥導(dǎo)致的疾病(例如，先天性白內(nèi)障(congenital cataract)，后天性白內(nèi)障(acquired cataract))等。
[0163]在移植治療中，由于組織相容性抗原的差異導(dǎo)致的移植排斥通常是成問題的，然而，該問題可以通過使用從移植接受者的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)得到解決。即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用從接受者的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)作為本發(fā)明的方法中的多能干細(xì)胞，并且，制備對(duì)于所述接受者來說在免疫學(xué)上是自體的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織并將其移植到所述接受者。
[0164]此外，通過本發(fā)明獲得的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織可以用于篩選和評(píng)估藥物。具體地，由于通過本發(fā)明獲得的眼前段組織或其部分結(jié)構(gòu)、或其前體組織具有與活生物體中的眼前段組織或其前體組織的結(jié)構(gòu)極其相似的高等結(jié)構(gòu)(如由視網(wǎng)膜、晶狀體和角膜以及具有層形式的角膜上皮(優(yōu)選是分層的角膜上皮)、角膜基質(zhì)和角膜內(nèi)皮的各前體組織的角膜前體組織的鄰接的立體形成所證實(shí)的)，其可以用于篩選用于以下的治療藥物:由眼前段組織的病癥導(dǎo)致的疾病，和受損的眼前段組織，藥物產(chǎn)品和化妝品的副作用和毒性測(cè)試(例如，角膜刺激測(cè)試的替代測(cè)試)，以及開發(fā)用于眼前段組織的疾病的新的治療方法等。
[0165]在下文中通過參考以下實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是示例性的，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0166]實(shí)施例1:通過人ES細(xì)胞的懸浮聚集物培養(yǎng)的晶狀體和角膜前體組織的自組織
[0167](方法)
[0168]通過胰蛋白酶處理，將人ES細(xì)胞(KhES-1;視網(wǎng)膜特異性基因Rx中敲入熒光蛋白基因Venus)分散為單個(gè)細(xì)胞，并且按照SFEBq方法(Nakano等人，Cell StemCell，10(6): 771-785，2012)，形成聚集體，并且在存在5%0)2的條件下在37°(3進(jìn)行懸浮聚集體培養(yǎng)，用于分化誘導(dǎo)。將分散的5000個(gè)人ES細(xì)胞接種在涂敷有低細(xì)胞吸附性表面涂層的V底96孔板的每個(gè)孔中，并且使用添加有5%KSR(Knockout Serum Replacement)的不含生長(zhǎng)因子的化學(xué)合成的培養(yǎng)基(不含生長(zhǎng)因子的化學(xué)成