液滴儲(chǔ)存方法
【專利說(shuō)明】液滴儲(chǔ)存方法
[0001]本發(fā)明涉及在基板表面上儲(chǔ)存液滴的方法。具體地，其涉及各自含有一個(gè)或多個(gè)單核苷酸或寡核苷酸的液滴的儲(chǔ)存。所述方法可以用于非常大量的微液滴的儲(chǔ)存和表征，如可以在來(lái)源于天然存在的或合成的DNA或RNA的多核苷酸分析物的測(cè)序中生成的。
[0002]遺傳物質(zhì)的下一代測(cè)序已經(jīng)總體上對(duì)生物科學(xué)并且由其是醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了顯著影響，因?yàn)闇y(cè)序的單位成本隨著越來(lái)越快的測(cè)序機(jī)器的上市而降低。因此，在一種這樣的機(jī)器中，通過(guò)首先分解為多個(gè)較小的多核苷酸片段將雙鏈DNA分析物間接測(cè)序，所述多核苷酸片段中的每一個(gè)首先在一條鏈的兩端腺苷酸化，從而單鏈第一寡核苷酸可以通過(guò)與未配對(duì)的腺嘌呤堿基雜交結(jié)合至其互補(bǔ)體的兩端。之后對(duì)由此得到處理的片段進(jìn)行尺寸選擇并且捕獲在涂布有結(jié)合的單鏈第二寡核苷酸的表面上，所述第二寡核苷酸本身是與第一寡核苷酸的序列互補(bǔ)體，從而實(shí)際上可以通過(guò)進(jìn)一步雜交形成表面結(jié)合的雙鏈片段的文庫(kù)。在隨后的聚集步驟中，之后在表面上使用延伸和等溫橋連反應(yīng)將這些文庫(kù)成分克隆擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)次以利用未使用的第二寡核苷酸。實(shí)際上，這產(chǎn)生了致密濃度的通過(guò)其鏈中的一個(gè)結(jié)合至表面的多核苷酸片段。之后移除每個(gè)片段的未結(jié)合的互補(bǔ)鏈以留下結(jié)合的單鏈片段準(zhǔn)備用于測(cè)序。在測(cè)序階段中，引發(fā)這些單鏈片段中的每一個(gè)，并且其互補(bǔ)鏈?zhǔn)褂镁酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)和雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四種特征性核苷酸堿基的混合物通過(guò)延伸重新形成。每種ddNTP類型是用在不同波長(zhǎng)發(fā)熒光的不同熒光團(tuán)標(biāo)記的部分末端封閉的。之后延伸反應(yīng)采取三步驟循環(huán)的形式;首先相關(guān)ddNTP結(jié)合至生長(zhǎng)鏈;其次，通過(guò)照射樣品并且檢測(cè)熒光的波長(zhǎng)來(lái)確認(rèn)其含有的核苷酸堿基以及最終移除末端封閉及其相關(guān)的熒光團(tuán)以允許接下來(lái)的延伸事件發(fā)生。通過(guò)這種方式，可以逐個(gè)堿基地構(gòu)建互補(bǔ)鏈的序列。將理解的是，盡管這個(gè)途徑可以是高度自動(dòng)化的并且可以生成高準(zhǔn)確性的序列讀取，其操作速度受延伸循環(huán)速率的限制。因此，在實(shí)踐中，技術(shù)的使用傾向于包括平行加工相對(duì)短的多核苷酸片段和組裝來(lái)自由其得到的各種讀取的整個(gè)序列。這本身可能會(huì)導(dǎo)致計(jì)算的復(fù)雜性和潛在的誤差引入。
[0003]最近已經(jīng)做出努力，開(kāi)發(fā)備選的直接測(cè)序方法。例如，WO 2009/030953公開(kāi)了一種新型快速測(cè)序儀，其中尤其是單鏈或雙鏈多核苷酸樣品(例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸堿基或堿基對(duì)的序列通過(guò)將其轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)納米孔基板而被讀取，所述納米孔基板設(shè)置有在納米孔的出口內(nèi)或附近并置的等離子納米結(jié)構(gòu)(plasmonic nanostructure)。在這種設(shè)備中，等離子納米結(jié)構(gòu)限定了檢測(cè)窗口(基本上為電磁場(chǎng))，在其中通過(guò)與入射光的相互作用以特征性的方式依次誘導(dǎo)每個(gè)核苷酸堿基(任選標(biāo)記的)發(fā)熒光或拉曼散射光子。之后遠(yuǎn)程檢測(cè)由此生成的光子，放大并且轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)流，其信息內(nèi)容是與多核苷酸相關(guān)的核苷酸堿基序列特有的。這種序列之后可以使用在編程至與其整合的微處理器中或與其連接的輔助計(jì)算設(shè)備中的相應(yīng)軟件中包含的計(jì)算算法來(lái)從數(shù)據(jù)流中找回。在例如Adv.Mat.2004，16(19)pp.1685-1706中，可以發(fā)現(xiàn)使用等離子納米結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的共振特征的進(jìn)一步背景。
[0004]例如，在US6627067、US6267872和US6746594中描述了另一種用于快速測(cè)序多核苷酸的裝置。以其最簡(jiǎn)單的形式，這種設(shè)備采用電極代替等離子納米結(jié)構(gòu)來(lái)限定整個(gè)基板中或者在納米孔的出口中或周圍的檢測(cè)窗口。之后在整個(gè)電極中施加電勢(shì)差并且，并且作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)量在其之間流動(dòng)的離子介質(zhì)的電特征的變化，所述變化是多核苷酸和相關(guān)的電解質(zhì)通過(guò)納米孔的電泳轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)果。在這種裝置中，在各個(gè)單獨(dú)的核苷酸堿基通過(guò)檢測(cè)窗口時(shí)，它們連續(xù)地阻塞和開(kāi)啟所述檢測(cè)窗，引起產(chǎn)生電流或電阻率的特征性波動(dòng)的‘事件’。然后，利用這些波動(dòng)來(lái)生成適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)流，用于如上所述的分析。
[0005]穩(wěn)定的液滴流，尤其是微液滴流的產(chǎn)生，是已經(jīng)具有分子生物學(xué)應(yīng)用的另一個(gè)技術(shù)發(fā)展領(lǐng)域。例如，US7708949公開(kāi)了用于在油中生成穩(wěn)定水滴的新型微流體方法，而例如US2011/0250597描述了利用這種技術(shù)生成含有核酸模板(通常為多核苷酸DNA或RNA片段)和使得模板能夠利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的多個(gè)引物對(duì)的微液滴。涉及所述領(lǐng)域的其他專利申請(qǐng)通常包括 JP2004/290977、JP2004/351417、US2012/0122714、US2011/0000560、US2010/01376163、US2010/0022414和US2008/0003142。
[0006]US 6277334描述了其中在通過(guò)設(shè)置有反應(yīng)位點(diǎn)的多孔反應(yīng)支持物之后將第一和第二液滴引入至反應(yīng)孔中的裝置，在所述反應(yīng)位點(diǎn)處可以引起在第一和第二液滴中含有的核苷酸之間發(fā)生反應(yīng)。然而，沒(méi)有提到由液滴流體生成液滴流和生成來(lái)源于前體多核苷酸分析物的有序的單核苷酸流。
[0007]US 2004/0197817涉及用于在基板上通過(guò)將含有多核苷酸的液滴沉積至基板上來(lái)制造多核苷酸陣列的裝置。這種裝置同樣不涉及出于儲(chǔ)存測(cè)序信息的目的而印刷包含液滴流體的液滴流和來(lái)源于前體多核苷酸分析物的有序的單核苷酸流。
[0008]US 2010/0015614描述了用于使用微液滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增接著毛細(xì)管電泳分析，基于芯片分選、擴(kuò)增和表征生物材料的裝置。所述裝置包括平面基板，所述平面基板包括一個(gè)或多個(gè)使用含有例如來(lái)源于細(xì)菌細(xì)胞或病毒的裂解物的微液滴填充的微反應(yīng)器。然而，沒(méi)有教導(dǎo)由液滴流體生成液滴流和生成來(lái)源于前體多核苷酸分析物的有序的單核苷酸流。
[0009]EP 1933138涉及用于通過(guò)使用液滴印刷法在其上沉積多個(gè)常規(guī)生物探針(寡核苷酸等)來(lái)制造生物測(cè)定基板陣列的方法。再一次地，沒(méi)有教導(dǎo)由液滴流體生成液滴流和生成來(lái)源于前體多核苷酸分析物的有序的單核苷酸流。
[0010]最近，在我們之前的申請(qǐng)681217772.1、681306444.9和681306445.6中，我們已經(jīng)描述了新型的測(cè)序方法，其涉及逐步焦磷酸解或核酸外切多核苷酸以生成有序的核苷酸流，其可以被逐個(gè)捕獲至相應(yīng)的微液滴流中。之后，可以對(duì)每個(gè)液滴進(jìn)行化學(xué)和/或酶操作以顯示其最初含有的特定核苷酸。然而，數(shù)百萬(wàn)個(gè)可能通過(guò)這種方法生成的液滴的分析經(jīng)常需要將液滴儲(chǔ)存一段時(shí)間，與此同時(shí)在其中發(fā)生的各種化學(xué)和/或生物反應(yīng)進(jìn)行到完成。之前，出于儲(chǔ)存目的，我們已經(jīng)公開(kāi)了液滴流流過(guò)的腔室，其適用于以嚴(yán)格順序捕獲并保持液滴。然而，盡管當(dāng)所分析的多核苷酸相對(duì)短時(shí)，這種腔室是適合的，而當(dāng)應(yīng)用于較長(zhǎng)的多核苷酸時(shí)，其使用變得有問(wèn)題，因?yàn)榇罅恳旱窝杆賹?dǎo)致不希望的腔室中背壓的積累，進(jìn)而限制了微液滴流的流動(dòng)。
[0011]我們因此已經(jīng)開(kāi)發(fā)了備選方法，其實(shí)際上涉及在基板的表面上的離散的位置儲(chǔ)存液滴，在那里可以將它們維持直到它們準(zhǔn)備用于分析。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種儲(chǔ)存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一個(gè)或多個(gè)單核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流體，其特征在于在相應(yīng)的唯一位置將每個(gè)液滴依次引入至基板的表面上的步驟，并且其特征還在于通過(guò)下列過(guò)程制備所述液滴流:所述過(guò)程包括由分析物通過(guò)逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的核苷酸流并且將每個(gè)核苷酸捕獲在相應(yīng)液滴中的步驟。
[0012]在其上儲(chǔ)存液滴的基板原則上可以由包括玻璃、聚合物、復(fù)合材料和金屬在內(nèi)的任何惰性材料制成。在一個(gè)實(shí)施方案中，基板是尤其是在可見(jiàn)光或近紫外光的頻率處對(duì)電磁輻射透明的，例如玻璃或透明塑料。在另一實(shí)施方案中，其能夠反射這種電磁輻射。在又一個(gè)實(shí)施方案中，基板是在液滴遞送系統(tǒng)下方并置的具有操作表面的片材。在這種實(shí)施方案中，緊接著在液滴遞送系統(tǒng)下方的表面可以是平面的或無(wú)輪廓的(un-profiled)或設(shè)置有如溝槽、通道、孔、凸起、凹陷、孔洞、柱和其他隆