一種生物法制備可可堿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物法制備可可堿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 可可喊（Theobromine ;3, 7-Dimethylxanthine)為甲基黃噪呤類生物喊，別名： 3, 7-二甲基黃嘌呤。化學(xué)名稱：3, 7-二氫-3, 7-二甲基-1H-嘌呤-2, 6-二酮。存在于可 可樹和巧克力中。同屬這一類的還有茶堿和咖啡因。白色單斜形針狀結(jié)晶性粉末。微溶于 水、中度溶于胺，不溶于苯、醚、四氯化碳和氯仿。溶于堿、濃酸和20%堿式磷酸鈉水溶液。 與咖啡因的區(qū)別在于1位是否甲基化?？煽蓧A具有較強(qiáng)和持久的利尿作用，有較強(qiáng)的擴(kuò)張 冠狀動脈、興奮心肌及松弛氣管平滑肌的作用，對中樞的興奮作用較弱。對橫紋肌有直接 作用，具有增高肌肉的興奮性，增強(qiáng)骨骼肌的機(jī)能?？煽蓧A在國內(nèi)主要作為復(fù)方制劑銷售， 可以制成止咳平喘類藥物：復(fù)方茶堿片和肺寶三效片，其中復(fù)方茶堿片所占份額最大。
[0003] 可可堿的主要功效體現(xiàn)在以下幾個方面：1、強(qiáng)效的減肥原料。2、磷酸二酯酶抑制 劑，弱腺苷受體拮抗劑，平滑肌松弛劑。3、利尿、心肌興奮、血管舒張、平滑肌松弛等作用。
[0004] 可可堿的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)法。如下所述：1、一甲脲法生產(chǎn)可可堿：主要涉及 到縮合、環(huán)合等多個步驟的全化學(xué)合成反應(yīng)，會有甲基黃嘌呤以及丙酮等副產(chǎn)物產(chǎn)生。反應(yīng) 過程中廢水排放量高，環(huán)保壓力巨大?；瘜W(xué)反應(yīng)步驟較多，其中縮合、環(huán)合、亞化收率約為 75%，還原、酰化閉環(huán)收率為75%，甲化收率75%，精制收率為85%。該方法為目前可可堿 生產(chǎn)主流方法，成本較高。2、咖啡因法生產(chǎn)可可堿：以咖啡因?yàn)榈孜锷a(chǎn)可可堿的方法涉及 到2步化學(xué)開環(huán)反應(yīng)，中間產(chǎn)物生成咖啡啶（油狀），會有分層現(xiàn)象。最終產(chǎn)物中有一定數(shù) 量的咖啡因污染到產(chǎn)物可可堿中去，需要再次分離等步驟。此方法毒性大，成本高，收率為 48%〇
[0005] 目前國內(nèi)外關(guān)于生物法、酶法合成可可堿的相關(guān)報道很少。CN1088259A公開了從 假單胞菌菌中分離出來的一段具有咖啡因脫甲基化酶的DNA片段。通過將該片段中編碼 的基因在重新轉(zhuǎn)化回敲除該基因的原始假單胞菌的方法來驗(yàn)證其脫甲基酶活性。但是未 表明此條基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)與活性情況。CN1495261A公開了一種咖啡因生 物合成體系基因組的聯(lián)合利用，其要求保護(hù)一種生產(chǎn)7-甲基黃嘌呤、可可堿或咖啡因的方 法，該方法保護(hù)一種由黃嘌呤底物基因串聯(lián)合成可可堿以及咖啡因的方法。2012年Ryan M. Summers等從實(shí)驗(yàn)室分離的P. putida CBB5菌株中克隆到一系列的黃噪呤代謝途徑相關(guān) 基因，并初步對其表達(dá)活性進(jìn)行研究，隨后申請專利。CN1143115A公開了一種生產(chǎn)3-甲 基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法，其要求保護(hù)生產(chǎn)由式（II)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌 呤的方法，該方法包括在含有由式（I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養(yǎng)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)用重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主的假單胞菌屬轉(zhuǎn)化體，以培養(yǎng)物中產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤 并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
[0006] 酶法合成可可堿理論可行，但由于咖啡因脫甲基化酶的特殊反應(yīng)需求：其需要耦 合專一配對的還原酶對其進(jìn)行供氫研究并大量消耗輔酶NADH，作為單加氧酶是需要氧氣參 與反應(yīng)。去甲基化酶與還原酶含有一個或多個Fe-S中心簇，常規(guī)分離表達(dá)困難，并且耦合 輔酶循環(huán)用酶對其整個催化體系要求更高。因而無法直接應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化研 究。
[0007] 生物法生產(chǎn)雖然對技術(shù)以及設(shè)備要求高。但由于此方法具有環(huán)保壓力小、反應(yīng)專 一性高、產(chǎn)物分離純化容易突出等優(yōu)勢已經(jīng)成為未來可可堿研發(fā)生產(chǎn)的主流方向。其中篩 選、構(gòu)建出可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的高活性、基因工程菌株，降低生產(chǎn)成本更顯得尤為重 要。研發(fā)關(guān)鍵在于尋找到可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的含有高活性、高專一性C1位咖啡因脫甲 基酶基因菌株，并進(jìn)一步提高底物濃度獲得最佳可可堿轉(zhuǎn)化率與收率，提高酶活力，降低生 產(chǎn)成本。最終實(shí)現(xiàn)利用基因工程大腸桿菌全細(xì)胞代謝耦合的方法制備可可堿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種生物法制備可可堿的方法，本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段，開發(fā) 了一種利用基因工程大腸桿菌全細(xì)胞生物法催化咖啡因去甲基化生成可可堿的方法。該方 法在極大程度上提高了可可堿的表達(dá)量與酶活力。
[0009] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種生物法制備可可堿的方法，所述方法是在C1咖啡因脫甲基化 酶CDMw或其突變體CDMm的催化作用下，進(jìn)行咖啡因?qū)Ｒ坏腃1位脫甲基化，從而得到可可 堿。
[0011] 本發(fā)明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶CDMw具有如序列表的序列號1所示的核酸 序列。
[0012] 本發(fā)明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶突變體序列CDMm具有如序列表的序列號2 所示的氨基酸序列。
[0013] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備可可堿的方法包括：利用含有C1咖啡因 脫甲基化酶CDMw或其突變體CDMm的基因工程重組菌，進(jìn)行咖啡因?qū)Ｒ坏腃1位脫甲基化， 從而得到可可堿。
[0014] 作為任選的技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備可可堿的方法包括：利用含有輔酶循環(huán) 用酶和C1咖啡因脫甲基化酶CDMw和/或其突變體CDMm的基因工程重組菌，進(jìn)行咖啡因?qū)?一的C1位脫甲基化，從而得到可可堿。
[0015] 本發(fā)明中，所述基因工程重組菌中咖啡因脫甲基化酶基因來源優(yōu)選但不限于假單 胞菌，例如還可以是枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌等等。
[0016] 優(yōu)選地，所述輔酶循環(huán)用酶為葡萄糖脫氫酶，底物為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0017] 本發(fā)明中，所述基因工程重組菌的宿主細(xì)胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母、假 單胞菌等，優(yōu)選但不限于上述宿主細(xì)胞。由于咖啡因脫甲基化酶在不同宿主細(xì)胞中酶活力 表現(xiàn)差異較大，因而優(yōu)選酶活力最高的大腸桿菌。
[0018] 本發(fā)明中，所述C1咖啡因脫甲基化酶CDMw或其突變體CDMm的表達(dá)載體包括 PET-22b、pET-28a(+)、pET-29a、pwb980、pA0815 或 Ppic9k 等等。例如可以采用包括所有含 有必須表達(dá)元件（啟動子、多克隆位點(diǎn)、終止子等）的任何載體，例如Novagen公司的原核 表達(dá)pET系列的氨節(jié)抗性載體、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pwb980、畢赤酵母表達(dá)載體pA0815， pPIC9k等等以及多種自殺質(zhì)粒。
[0019] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備可可堿的方法可以為：利用Cl咖 啡因脫甲基化酶CDMw或其突變體序列CDMm與大腸桿菌自身電子傳遞鏈耦合配合的大腸桿 菌，進(jìn)行咖啡因?qū)Ｒ坏腃1位脫甲基化，從而得到可可堿。
[0020] 作為任選的技術(shù)方案，本發(fā)明所述的制備可可堿的方法還可以為：利用含有輔酶 循環(huán)用酶GH和C1咖啡因脫甲基化酶CDMw和/或其突變體序列CDMm多基因串聯(lián)與大腸桿 菌自身電子傳遞鏈耦合配合的大腸桿菌，進(jìn)行咖啡因?qū)Ｒ坏腃1位脫甲基化，從而得到可可 堿。
[0021] 本發(fā)明中，C1脫甲基化酶CDMw、CDMm、GH與全細(xì)胞耦合方式可以通過其他類型的 基因串聯(lián)方式耦合，例如可以是：不同的基因串聯(lián)順序，不同的RBS序列類型等，達(dá)到基因 串聯(lián)重組表達(dá)的最終目的。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0023] 本發(fā)明的催化反應(yīng)體系具備成分較為簡單，無毒性化學(xué)試劑污染，利于產(chǎn)物可可 堿的分離和純化等優(yōu)點(diǎn)，提高了可可堿的轉(zhuǎn)化率和收率，其中，可可堿的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到 85%，為生物法催化咖啡因生產(chǎn)可可堿路線奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0024] 圖1是C1咖啡因脫甲基化酶CDMw的瓊脂凝膠電泳圖譜；
[0025] 其中，圖1中Ml為Trans 2K Marker，從上到下大?。╞p)分別為100、250、500、 750、1000、2000、3000、5000、8000 ;圖1