一類大環(huán)內酯類化合物及其制備方法和在制備抗海洋生物污損涂料中的應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于天然產物領域，具體涉及一類大環(huán)內酯類化合物及其制備方法和在制 備抗海洋生物污損涂料中的應用。
【背景技術】：
[0002] 大環(huán)內酯類化合物包括大環(huán)單內酯和大環(huán)多內酯，具有廣泛的生物活性，其中大 環(huán)多內酯中一些對稱的十六元環(huán)二內酯類化合物雖然結構較簡單，但由于其結構的新穎性 和生物活性的顯著性，吸引了許多有機合成研究者，而天然十八元環(huán)二內酯類化合物研究 相對較少。

【發(fā)明內容】
：
[0003] 本發(fā)明的目的是提供一類具有抗海洋生物污損活性的大環(huán)內酯類化合物。
[0004] 本發(fā)明通過多種柱層析及一維、二維核磁共振波譜，從真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的發(fā)酵產物中分離得到一類新的大環(huán)內酯類化合物，這種化合物具有抗海洋生 物污損活性，可用于制備抗污損涂料，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005] 本發(fā)明的3個大環(huán)內酯類化合物，其結構如式(I)所示：
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供如式（I)所示的大環(huán)內酯類化合物的制備方法，其特 征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)制備真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021 的固體發(fā)酵物；
[0009] (2)將步驟（1)得到的固體發(fā)酵物用丙酮浸提，丙酮浸提液濃縮后得到丙酮浸膏， 丙酮浸膏再用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶劑萃取，濃縮得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提 取物或氯仿提取物；
[0010] (3)將步驟(2)所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物經過中壓、 常壓硅膠柱層析，以水-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油 醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)分別作為正反相洗脫劑，從體積比100:0到0:100進行梯度洗脫，用薄 層層析追蹤合并組分，經過Sephadex LH-20凝膠柱層析得到粗品，經高效液相色譜純化，得 到式(I)所示的大環(huán)內酯類化合物1-3;
[0011 ] 步驟（1)中所述的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的固體發(fā)酵物是通過將 真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接種到真菌適用的培養(yǎng)基中，在通常的發(fā)酵條件下 制得。優(yōu)選的制備方法是將真菌1'1'；[01101301:巧8 6€;^86 0??303021接種于?04瓊脂培養(yǎng)基 中，28°C培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)有菌種的平板，然后將平板中菌種接種入液體培養(yǎng)基中，于轉速 180r/min搖床、溫度28°C培養(yǎng)3天，得到種子液，再將種子液接種于大米培養(yǎng)基中，于28°C靜 置培養(yǎng)30天，得到真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的大米發(fā)酵產物，所述的液體培養(yǎng) 基為每升含有葡萄糖IOg，甘露醇20g，麥芽糖20g，玉米漿Ig，味精IOg，KH 2P04 0.5g，MgS04 0.3g，酵母浸膏3g，海鹽30g，余量為水，pH 7.0，所述的大米培養(yǎng)基為:在每600ml水中，加入 大米400g，酵母膏2g，葡萄糖2g，海鹽18g。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021在制備上述大 環(huán)內酯類化合物1、2或3中的應用。
[0013] 通過體外抗海洋污損生物幼蟲附著活性篩選實驗，結果顯示:本發(fā)明的如式（I)所 不的化合物1抑制藤壺幼蟲和草苔蟲幼蟲附著的EC5Q值分別為7.3yg/mL和2.5yg/mL，LC5〇/ EC5Q值分別為大于40.5和37.4;化合物2抑制草苔蟲幼蟲附著的EC5q值為9.2yg/mL，LC 5Q/EC50 值為大于100;化合物2和3在濃度25yg/mL時抑制藤壺幼蟲附著的抑制率分別為32 %和 41 %;化合物3在濃度25yg/mL時抑制草苔蟲幼蟲附著的抑制率為29%。可見，化合物1和2有 良好的抗海洋生物污損活性，化合物3有一定的抗海洋生物污損活性。
[0014] 因此，本發(fā)明的第四個目的是提供如式（I)所示的大環(huán)內酯類化合物在制備抗海 洋生物污損涂料中的應用。
[0015]所述的抗海洋生物污損涂料優(yōu)選為抗藤壺幼蟲或草苔蟲幼蟲附著涂料。
[0016] -種抗海洋生物污損涂料，其特征在于，包括有效量的作為活性成分的所述的大 環(huán)內酯類化合物和可以接受的載體。
[0017]所述的抗海洋生物污損涂料優(yōu)選為抗藤壺幼蟲或草苔蟲幼蟲附著涂料。
[0018] 本發(fā)明的如式（I)所示的大環(huán)內酯類化合物能抑制藤壺幼蟲和草苔蟲幼蟲的附 著。將本發(fā)明式（I)所示的大環(huán)內酯類化合物單獨或組合滲入或擴散于成膜天然樹脂，聚乙 烯乙酸乙酯共聚物以及其它可水解，可溶或不溶性樹脂等聚合物中，制成抗污損涂料，抗污 損涂料能釋放出足夠量的有效成分至表面達到防污作用。這些化合物是天然活性成分，而 且均不易溶于水，極易溶于氯仿、乙酸乙酯等低極性有機溶劑，具有良好的親油性，因此可 單獨或組合應用于制備海洋防污劑中，具有良好的應用前景。
[0019] 本發(fā)明的Trichobotrys effuse DFFSCS021于2015年8月20日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，其保藏編號:CCTCC NO.M 2015496。
【附圖說明】：
[0020] 圖1是化合物1和2中的關鍵HMBC和1H-1H COSY圖，其中1代表化合物1，2代表化合物 2；
[0021]圖2是化合物1的水解和Morsher酯化產物；
[0022] 圖3是化合物1的Morsher酯化產物的Δ δ(δ5-δκ)值。
【具體實施方式】：
[0023] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024] 實施例1:大環(huán)內酯類化合物1-3的制備
[0025]每升液體培養(yǎng)基是這樣配制的:將10克葡萄糖，20克甘露醇，20克麥芽糖，1克玉米 漿，10克味精，0.5克KH2P〇4，0.3克MgS〇4，3克酵母浸膏，30克海鹽混合，用水定容到IL，調pH 7.0。將液體培養(yǎng)基裝入約5個500mL的三角燒瓶中，每瓶約150mL，在121°C高壓蒸汽滅菌25 分鐘。
[0026]大米培養(yǎng)基是這樣配制的：每個5L三角瓶中盛裝大米400g，酵母膏2g，葡萄糖2g， 海鹽18g，用水定容到600mL，混勻，121°C高壓蒸汽滅菌25分鐘，共6瓶備用。
[0027] 用移液槍吸約2微升的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021菌種接種入PDA瓊脂 培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)有菌種的平板，然后用竹簽從平板中挑約3微升菌種接種 入含150mL上述液體培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，于搖床(轉速180r/min)溫度28°C培養(yǎng)3天， 得到種子液后，在上述盛有大米培養(yǎng)基的5L三角瓶中接種50mL種子液，于28°C靜置培養(yǎng)30 天后，收取發(fā)酵產物。
[0028]將經大米培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的發(fā)酵產物每瓶用2L丙酮浸泡、搗碎，在用組織勻漿機 攪拌均勻，超聲破壁30分鐘，減壓抽濾得到濾液，將濾液減壓蒸餾除去丙酮后，再用水制成 水混懸液，再用20L乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯提取物29.93g。乙酸乙酯提取物 用正相硅膠（200-300目）干法拌樣后，裝入玻璃層析柱(含正相硅膠200-300目約300g)，進 行常溫柱層析，以氯仿-甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0到0:100進行梯度洗脫，根據(jù)薄層 層析(GF 254硅膠板)情況合并得至1」7個流分(Fr. I-Fr.7)，回收洗脫溶劑，蒸干流分用甲醇轉 移。其中在薄層層析板(GF254硅膠板)上用氯仿-甲醇(體積比8:2)能展開的流分Fr.5通過硅 膠柱(含正相硅膠100-200目約100g)進行常溫柱層析，以體積比為20:1、10 :1、4:1、1:1的氯 仿-甲醇作為洗脫劑進行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析(GF254硅膠板)情況合并得到4個亞流分 $1'.5-1+1'.5-4)。其中含有在薄層層析板(6?254硅膠板)上用氯仿-甲醇(體積比8:2)展開 時Rf值大約〇. 4~0.7主點的流分Fr. 5-3進一步經過凝膠Sephadex LH-20柱層析，用CHCl3/ MeOH(I = I)洗脫合并得至丨」3個亞流分(Fr.5-3-1-Fr.5-3-3);其中含有在薄層層析板(GF254娃 膠板)上用氯仿 -甲醇(體積比8:2)展開時Rf值大約0.6~0.7主點的流分Fr. 5-3-1進一步經 過高效液相半制備（檢測波長為254nm，流速為3mL/min，色譜柱為YMC-Pack IOmmX 250mm， 流動相為體積比為25:75的甲醇-水），接收出峰時間為16分鐘的流分得到化合物1;其中含 有在薄層層析板(GF254硅膠板)上用氯仿-甲醇(體積比8: 2)展開時Rf值大約0.4~0.5主點 的流分?^5-3-2采用高效液相半制備（檢測波長為254腦，流速為3111171^11，色譜柱為￥1(：-Pack IOmmX 250mm，流動相為體積比為15:85的甲醇-水)分別在出峰時間為53 · 0和58 · 0分 鐘時分離純化得到化合物3和2。
[0029]其中化合物1的結構解析如下：
[0030] 通過高分辨質譜(HRESIMS)在m/z 423.1987[M+Na]+處給出準分子離子峰，結合 匪R波譜數(shù)據(jù)，得知化合物1的分子式為C2qH32O8i31H譜（表1)中顯示分子中有甲基δ Η 1.05 (3H，d，J = 5.5Hz)，3個亞甲基δΗ 1.74(lH，m)，1.54-1.61(2H，m)，1.34-1.44(3H，m)，3個氧 次甲基3[13.92(1!1，111)，5.07(1!1，(1，了 = 6.0抱），3.55(1!1，111)，2個烯次甲基3[15.79(1!1，(1，了 = 15.5抱），6.62(1!1，(1(1，1 = 6.5，15.5抱）.13(：譜(表1)顯示分子中有10個碳信號，包括1個甲基 (δ。22.4)，3個亞甲基(S c 30.4,27.1,40.9)，3個氧次甲基（Sc 69.3,69.9,62.6)，2個烯次 甲基（δ。120.6，150.3)，及一個酯基（δ。165.0).結合分子式，以上核磁數(shù)據(jù)說明該化合物 由二個對稱的片段(A鏈和B鏈)組成。通過HSQC，HMBC，1H-1H COSY譜圖數(shù)據(jù)分析（圖1 )，確定 了化合物1的平面結構?；衔?的絕對構型進一步通過水解反應和MOSHER酯化反應（圖2) (Arnone,A.；Nasini,G.；Pava,0.V.Phytochemistry 1998,48,507-510;Freire,F·;Seco, J.M.；Emilio,Q.；Riguera,R.J.Org.Chem.2005,70,3778-3790；Oh,D.C.；Scott,J.J.； Currie，C.R. ;(：1&"7，1.0邙.1^?.2009，11，633-636)得到確定，將酯化反應產物的&