一種制備多孔酶微球的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶領(lǐng)域，特別是一種制備多孔酶微球的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]面對越來越嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)和能源危機(jī)，環(huán)境友好型的催化劑逐漸被大家認(rèn)同。酶催化因其具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、效率高等優(yōu)勢而得到越來越多的關(guān)注。但是，游離酶對所處環(huán)境十分敏感，在強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、高溫及部分有機(jī)溶劑中不夠穩(wěn)定，容易變性失活。而酶的固定化不僅可提高酶的穩(wěn)定性，還有利于酶的回收和重復(fù)利用及連續(xù)自動化生產(chǎn)，這對降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率具有重要意義。酶的固定化分為載體固定化與無載體固定化兩大類。通常來說，載體固定化酶可提高酶的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，但由于大量惰性載體的存在，嚴(yán)重降低了單位體積內(nèi)酶的濃度，還存在傳質(zhì)阻力大、酶的活性不高等問題。另外，固載化材料的制備過程較復(fù)雜，成本較高，對于某些特殊載體，不但價(jià)格昂貴，而且對生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)條件要求也很苛刻，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，無載體酶固定化技術(shù)就顯得很有吸引力。
[0003]無載體酶固定化技術(shù)中，交聯(lián)酶聚集體方法因其操作簡單，對實(shí)驗(yàn)條件要求低，酶的固載效率和回收率高，且適用于大多數(shù)酶的固定化而被廣泛應(yīng)用，但該方法制備的無載體固定化酶也存在一定問題，如交聯(lián)酶聚集體顆粒大小不均，可控制備性差，不利于交聯(lián)酶聚集體工業(yè)化應(yīng)用中高催化活性的發(fā)揮和后期的分離等；針對這些問題，Brady等(BMCB1techno 1., 2008，8，8?18)提出了球化無載體固定化酶技術(shù)，利用乳化法可以制備出0.5-10μηι的球形脂肪酶微粒，此球形微粒可進(jìn)一步團(tuán)聚形成ΙΟΟμπι左右的團(tuán)聚體，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了無載體固定化酶的可控制備，顆粒呈現(xiàn)球形，形貌規(guī)則，但是該脂肪酶微粒為無孔結(jié)構(gòu)。Lopez-Serrano等(B1technol.Lett.,2002,24,1379?1383)在制備脂肪酶交聯(lián)酶聚集體時(shí)，添加十二烷基硫酸鈉、辛基酚聚氧乙烯醚和冠醚添加劑，沉淀交聯(lián)后，添加劑被去除，得到有孔的交聯(lián)酶聚集體，但孔徑很小且不可控。王夢凡等(B1resource Technol.,2011，102(3)，3541?3545)采用大分子淀粉為致孔劑，制備得到多孔化交聯(lián)酶聚集體，該多孔化結(jié)構(gòu)有利于降低交聯(lián)酶聚集體對底物分子的傳質(zhì)限制，提高了無載體固定化酶的催化效率，但該方法制備的固定化酶微?？讖胶土娇煽匦圆睢楸苊膺@些缺陷，一種新的方法應(yīng)運(yùn)而生一模板法制備多孔固定化酶微粒。該方法因其固定化酶制備簡單、重復(fù)率高、形態(tài)可控、適用面廣而被廣泛應(yīng)用于固定化生物分子(Chem.Mater.，2008，20(3)，738?755)。生物分子通過滲透入到模板內(nèi)部，其后去除模板，而獲得精確復(fù)制模板形貌的多孔生物分子顆粒，且生物分子顆粒的性質(zhì)可以通過簡單選擇不同形式的模板來調(diào)控。然而該方法也有一定缺陷，即模板去除過程通常涉及茍1刻的條件，如聚合物(Topics in CurrentChemistry-Templates in Chemistry ΙΠ，2009，287，135?180)或二氧化娃模板的去除(Adv.Mater.，2006,18(6), 795?800)需經(jīng)過高溫分解或氫氟酸來去除，還有一些模板的去除涉及到有機(jī)溶劑，這些條件或試劑會破壞生物分子的結(jié)構(gòu)，造成其不可逆失活，同時(shí)也會由于溶脹或坍塌而破壞模板的支架。因此，要想利用模板技術(shù)獲得功能化的生物分子顆粒，需要找到一種可以在水相溫和條件下去除的合適的模板。多孔碳酸鈣或碳酸錳顆粒具有生物相容性，不僅價(jià)廉易得，還有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)也可以在溫和條件下溶解。此外，通過對兩種顆粒的粒度分布和內(nèi)部形貌的研究發(fā)現(xiàn)，其適合作為生物分子的模板。Volodkin課題組利用層層自組裝技術(shù)在溫和的模板去除條件下制備了聚合物微囊(J.Mater.Chem.，2004,14(14) ,2073?2081)。該課題組(Adv.Funct.Mater.,2013,23(1)，116?123)又在制備介孔碳酸鈣模板的基礎(chǔ)上，加入蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子靠水分子的蒸發(fā)以及毛細(xì)管作用進(jìn)入到碳酸鈣孔道內(nèi)部，而后經(jīng)戊二醛交聯(lián)和模板去除等步驟制備了多孔性蛋白質(zhì)微粒，該方法制備的多孔蛋白質(zhì)微粒形貌更規(guī)整，適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)(或酶)的多孔微粒制備。但該制備過程比較復(fù)雜、孔狀蛋白質(zhì)微粒易塌陷，且過程中加入了戊二醛交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白質(zhì)分子，戊二醛的存在會導(dǎo)致酶的活性降低，微粒形貌、粒徑可控制備性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前技術(shù)存在的不足，提供一種制備多孔酶微球的工藝方法。該方法以碳酸錳為模板，二硫蘇糖醇為還原劑，牛血清白蛋白為保護(hù)劑，通過共沉淀法來制備多孔酶微球，得到了形貌、孔徑可控的多孔酶微球。該方法采用新型固定化酶技術(shù)，提高了酶的活性、穩(wěn)定性和粒度的可控性，溫和條件下，廉價(jià)、高效。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]—種制備多孔酶微球的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將酶溶液、牛血清白蛋白溶液和硫酸錳溶液加入到反應(yīng)器中得到混合液，然后向混合液中加入碳酸氫銨溶液，磁力攪拌10?15秒后，靜置10?15min，在高速離心分離后，將沉淀用蒸餾水洗滌，即得酶-碳酸錳共沉淀顆粒；
[0008]其中，混合液中，酶濃度為I?4mg/mL,牛血清白蛋白濃度為6?9mg/mL，且酶和牛血清白蛋白濃度之和為10mg/mL，硫酸錳的濃度為0.15?0.25M，摩爾比硫酸錳與碳酸氫銨為1:1?5;
[0009](2)向所得的酶-碳酸錳共沉淀顆粒中加入pH值為7.5的二硫蘇糖醇溶液，磁力攪拌10?30min，高速離心分離后，將沉淀用pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液充分洗滌;將沉淀重新浸沒于PH值為7.5的磷酸鹽緩沖液中，室溫下磁力攪拌Ih，其后高速離心得到自組裝沉淀顆粒；
[0010]其中，二硫蘇糖醇溶液的濃度為0.1?0.5mM，體積比二硫蘇糖醇溶液:步驟(I)中混合液=1:1;
[0011](3)在步驟(2)得到的自組裝沉淀顆粒中加入乙二胺四乙酸二鈉溶液，室溫條件下震蕩反應(yīng)30min?lh，離心分離，棄去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌，即得多孔酶微球。
[0012]其中，乙二胺四乙酸二鈉溶液的濃度為0.1?0.3M，乙二胺四乙酸二鈉與硫酸錳的摩爾比為2?5:1。
[0013]所述的酶溶液中，酶為辣根過氧化物酶或脂肪酶，溶劑為pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0014]所述的步驟(1)、(2)和(3)中的高速離心的速度為5000?10000r/min。
[0015]本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)為:
[0016]①本發(fā)明基于無載體固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)，提出了模板法制備多孔酶微球。本發(fā)明以辣根過氧化物酶和脂肪酶為模型酶，在模板法制備酶-碳酸錳微球時(shí)加入牛血清白蛋白保護(hù)劑，實(shí)現(xiàn)了高性能生物催化劑的制備;基于碳酸錳有致孔作用，提出了無載體固定化酶制備時(shí)以碳酸錳為模板，實(shí)現(xiàn)了新型高效多孔酶微球形貌、粒徑、孔徑等的可控制備，進(jìn)而提高了固定化酶的活性和重復(fù)使用性；
[0017]②基于二硫蘇糖醇能斷裂酶分子內(nèi)的二硫鍵，當(dāng)其被去除后，酶分子能自組裝成固定化酶微粒的特點(diǎn)，結(jié)合模板法和碳酸錳的多孔結(jié)構(gòu)，提出了無交聯(lián)碳酸錳模板法制備多孔酶微球，實(shí)現(xiàn)了新型多孔固定化酶微球的制備。另外，因酶分子內(nèi)二硫鍵含量較少或處于酶分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，如直接用二硫蘇糖醇的加入和去除來組裝酶微粒，易造成微粒形貌、粒徑等不可控且不穩(wěn)定，牛血清白蛋白的添加除具有保護(hù)酶分子結(jié)構(gòu)外，還有助于酶分子自組裝成酶微粒。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
[0019]1.本發(fā)明制備多孔酶微球的方法，固定化酶微球的形貌、孔徑可控(通過改變硫酸錳與碳酸氫銨的化學(xué)計(jì)量比來調(diào)控形貌和孔徑的大小)，且有效提高了酶的穩(wěn)定性，相對于游離酶，其有更寬的PH適用范圍，且熱力學(xué)穩(wěn)定性更高(如游離的辣根過氧化物酶在60°C的磷酸緩沖液中孕育120min后，其活性僅剩初始酶活的5%，而多孔辣根過氧化物酶微球仍能保留其初始酶活的4 O %左右;2.碳酸猛是一種良好的I旲板材料，價(jià)廉易得，有良好的穩(wěn)定性且易于去除;3.本發(fā)明的制備工藝簡單，重復(fù)率高(重復(fù)使用7次后，其酶活仍能達(dá)到初始酶活的80%以上)、形態(tài)可控、適用面廣。
【附圖說明】
[0020]圖1為實(shí)施例1中模板碳酸錳的犯吸附-脫附等溫線和孔徑分布圖；(其中，大圖是碳酸錳的他吸附-脫附等溫線；中間的小圖是碳酸錳的孔徑分布圖)；
[0021 ]圖2為實(shí)施例1中多孔酶微球的電鏡圖片；
[0022]圖3為實(shí)施例1和4中多孔辣根過氧化物酶微球和多孔脂肪酶微球的重復(fù)使用性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明所用的脂肪酶、牛血清白蛋白和二硫蘇糖醇均購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0024]本發(fā)明所用的辣根過氧化物酶購于上海源葉生物科技有限公司。
[0025]本發(fā)明所用的乙二胺四乙酸二鈉購自天津江天化工技術(shù)有限公司。
[0026]本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖溶液為Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，不同pH值的緩沖液按如下方法配制得到:分別配制0.1M的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液，將兩者混合，通過調(diào)整兩者的體積比，即可得到所需的PH(用pH計(jì)標(biāo)定)。如:25°C下pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液(0.1M)的配$ij:取61mL的Na2HPO4溶液(0.1M)和39mL的NaH2PO4溶液(0.1M)混合即可；25°C下pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液(0.1M)的配制:取84mL的Na2HPO4溶液(0.1M)和16mL的NaH2PO4溶液(0.1M)混合即可。
[0027]所述的乙二胺四乙酸二鈉溶液的配制過程是將0.1?0.3mol的乙二胺四乙酸二鈉溶解于IL蒸餾水中，溶解時(shí)需做加熱處理，待其完全溶解后加入氫氧化鈉顆粒調(diào)節(jié)pH值至7.0。
[0028]所述的二硫蘇糖醇溶液的配制過程是首先將10mg的二硫蘇糖醇溶于0.65mL的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中配制成IM的二硫蘇糖醇溶液，然后用磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)對其稀釋，直至所需濃度。
[0029]實(shí)施例1:
[0030]模板碳酸錳的制備:取ImL0.25M的硫酸錳加入到反應(yīng)器中，其后加入等體積的0.5M的碳酸氫錢溶液，室溫條件下水浴鍋中磁力攪拌(650rpm) 1s，靜置I Omin使其形成穩(wěn)定的沉淀，lOOOOr/min離心2min，并用蒸餾水洗滌5次即得碳酸錳模板。因?yàn)橛晌?脫附等溫線的形狀可以測定材料的結(jié)構(gòu)特征(如材料的三維結(jié)構(gòu)、內(nèi)部孔直徑、孔的大小分布等)，所以對碳酸錳模板進(jìn)行了犯吸附-脫附表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果