專利名稱：轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種子包衣技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑。
農(nóng)作植物病害包括細菌、真菌和病毒病害。青枯病是一種細菌性病害，對馬鈴薯危害可減產(chǎn)25％，嚴重時導致絕收。中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心將人工合成抗菌肽基因?qū)胛覈R鈴薯主栽品種米拉，獲得抗病性提高1-Ⅲ級的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。目前，抗菌肽基因，已經(jīng)供給國內(nèi)外10多個研究單位，進行抗水稻白葉枯病、馬鈴薯軟腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜軟腐病、柑桔細菌性潰瘍病、桑樹和桉樹青枯病、櫻桃根腫病等基因工程的研究。
抗真菌病害的基因工程研究近幾年很活躍，科學家們已經(jīng)把幾丁質(zhì)酶基因、葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)抗病作用。此外，抗病毒的基因工程國內(nèi)進展也很快。中科院微生物研究所、北京大學已得到抗煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因煙草，并在東北、山東、河南等地區(qū)大面積試種。在水稻研究中已獲得了抗矮縮病毒的基因工程植株。不少單位也將抗菌肽基因相繼在水稻、大豆、番茄等作物上做試驗獲得很好效果，將抗菌肽基因轉(zhuǎn)到水稻里，培育出的植株能抗水稻常見的白葉枯病，并能穩(wěn)定遺傳。
目前防治農(nóng)作物病害仍然大量使用噴灑型、帶毒性的化學農(nóng)藥為主，對環(huán)境有嚴重污染，嚴重危害人類的生存和健康。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗病基因直接轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，因它是取之自然物種，方法先進，貼近自然，對環(huán)境和人類健康意義重大?，F(xiàn)在研究證實1、抗菌肽廣泛存在于動物(昆蟲)、植物和微生物體內(nèi)，采用一般提取純化方法難于獲取大量抗菌肽。
2、正常生物體內(nèi)抗菌肽降低或消失，就會出現(xiàn)細菌、真菌、病毒等感染而發(fā)生病害。
3、生物體在一定條件誘導下如物理學、化學、生物學等都能提高抗菌肽含量。用現(xiàn)代生物技術(shù)，重組抗菌肽基因均能在不同生物體內(nèi)互相轉(zhuǎn)移一即轉(zhuǎn)基因抗菌肽，如柞蠶抗菌基因可轉(zhuǎn)入沙田柚。
4、提取、純化的抗菌肽包括天然的、合成的、基因的，其結(jié)構(gòu)功能和特異性差異很小，也就是說種屬差異性不明顯，只有因抗菌肽種類不同作用強弱，范圍有存在差異。因此，同一種抗菌肽可以用于不同動、植物和微生物，如基因酵母菌抗菌肽可以抗植物的病原微物。
本發(fā)明的目的是利用種子包衣技術(shù)，提供一種轉(zhuǎn)基因家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種包衣添加劑，來防治農(nóng)作物病蟲害，取代現(xiàn)代化學藥物。
轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑，每100ml中包括，抗菌肽500-1000單位，吸水劑0-1％，磷礦粉2.5％,1065粉2.5％，硫酸鋅1％，甲基纖維4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
按每公斤包衣劑加5000-10000單位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水劑進行種子涂層處理，晾干，再將可作粘著劑用的4％甲基纖維素溶液按40ml拌0.5kg種子的比例充分拌勻，放入包衣機，邊旋轉(zhuǎn)邊加入制衣材料，并不斷稍加(在包衣中)噴水，待種料比1∶(4-5)時即可。
一、轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆繁育提取工藝流程家蠅雖然沒有完善的免疫防御體系，但卻具有高效的無細胞免疫系統(tǒng)?？咕氖羌蚁壝庖吆笱馨椭械囊活惪咕嚯模哂蟹肿恿啃?，熱穩(wěn)定，水溶性好，無免疫原性，抗菌譜廣等特點?，F(xiàn)在，它被認為是從細菌到高等哺乳動物普遍存在的一類防御性多肽，稱之為“第二防御體系”?？咕牟粌H抗菌譜廣，而且可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲，并對多種癌細胞及動物實全瘤有明顯的殺傷作用，而不破壞正常細胞。
抗菌肽即將成為一代新的抗菌、抗病毒抗癌藥物。但天然抗菌肽的來源少，成本高，無法滿足實際應用的需要。因此我們通過DNA重組技術(shù)實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆繁育家蠅收集蠅蛆獲得大量抗菌肽已成為現(xiàn)實。其工藝流程是抗菌肽基因工程家蠅的構(gòu)建→擴大工程蠅繁育→收集蠅蛆→蠅蛆滅菌技術(shù)處理→蠅蛆抗菌肽含量測試→低溫深凍、貯存原料→低溫粉碎、制成超微勻漿→抽提去除雜質(zhì)→濃縮→分離干燥→鑒定各項指標→調(diào)配不同規(guī)格制品→用于科子包衣添加劑。
該工藝具有如下顯著優(yōu)點工藝過程簡便；技術(shù)穩(wěn)定，具有很高的重復性；表達效率高，抗菌肽的收率可達到0.60mg/ml；規(guī)模靈活，改變工藝規(guī)模時不需要重新通過中試校驗工藝參數(shù)；轉(zhuǎn)基因工程家蠅蠅蛆繁育快，含量高，原料供應豐富并且價格低廉，適宜規(guī)?；a(chǎn)。
二、基因抗菌肽用于種類包衣添加劑的作用特點抗菌肽是一種有35個氨基酸組成的多肽化合物，其分子量為3835道爾頓，等電點大約為10左右，具有優(yōu)良的耐熱性，對極端的PH值環(huán)境和離子強度環(huán)境也具有優(yōu)良的抗性，同時，抗菌肽對胃蛋白酶具有一定程度的耐受性。
抗菌肽N端富含賴氨酸和精氨酸等陽離子型氨基酸，C端富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸并且酰胺化，其中間部墜毀則富含脯氨酸。通過對抗菌肽的圓二色性分析，抗菌肽表明能夠在一事實上條件下形成α-螺旋和β-折疊?？咕牡摩?螺旋具有近科完美的兩親性，被普遍認為是抗菌肽活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?？咕某吮憩F(xiàn)出對細菌具有強大的殺傷作用外，還表現(xiàn)出了對腫瘤細胞和真菌以及部分病毒的強大殺傷作用。種子進行種衣劑包衣，是集多學科成果于一體的綜合性高新技術(shù)，基因抗菌肽作為添加劑是增加科技含量的重要組成部分，也是防制農(nóng)作物病害重要措施，有十分顯著的經(jīng)濟效益。
三、基因抗菌肽種子包衣添加劑的應用范圍將基因抗菌肽現(xiàn)代生物工程技術(shù)應用于種子包衣，是一種新型種衣添加劑可廣泛用于小麥、玉米、花生、芝麻、大豆以及蔬菜、水果、花卉等和種衣添加劑。它是一種可有效殺死真菌的蛋白質(zhì)，殺菌力強，抗菌譜廣，分子量小。對動物(包括人體)及植物無毒、無害，對環(huán)境也不會造成污染，是一種符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)要求的環(huán)保型生物農(nóng)藥。
實施例1芝麻是重要的經(jīng)濟作物，為了解決與小麥騰薦接口，控制病害發(fā)生，提高單位產(chǎn)量，節(jié)省種子，用基因抗菌肽制作芝麻的包衣，這是因為包衣處理芝麻給芝麻穿上一層融吸水、營養(yǎng)、殺蟲殺藥保護衣，對苗期病菌害防治效果達100％，增產(chǎn)效果達45％以上，而且籽粒飽滿，成熟度高，1000粒增重明顯，具體實施方法是按每公斤包衣劑加8000單位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水劑進行芝麻種子凈層處理，晾干，再將4％甲基纖維溶解液粘著劑按40ml拌0.5公斤芝麻種子的比例充分拌勻放入大盆，用棒旋轉(zhuǎn)攪拌使其將種子均勻，此不斷加2.5％磷礦粉，2.5％1065粉，1％硫酸鋅，邊加邊噴水，待種料成1∶6即可。用此種辦法處理，可隨處理隨時播種，也可存放20天內(nèi)，若長期貯存可在最后工序中加膜制劑使芝麻種子外形成一層膜，以保護營養(yǎng)水份及相關(guān)成分不丟失和失活。
實施例21、首先稱取10公斤待包衣種子，置于盆式器皿中或足夠大的塑料薄膜上。然后將含有8000單位基因抗菌肽，1公斤乳劑倒在種子上，用不傷害種子的木棍或其它可以攪拌的工具，將種子與乳劑攪拌，或用手看著塑料薄膜的四個角反復折混，直到包衣均勻。
2、將包了衣的種子分散攤放在塑料薄膜上或干凈的地面上，在無陽光直接照射的地方，自然風干后即可播種。
3、最好在播種前一天包衣，風干至不粘即可播種。若有必要可以采用機械方法按上述過程包衣。
注乳劑中可按一定上比例復合配有強力吸收劑，微肥，稀土元素、微量元素，植物調(diào)節(jié)劑、抗菌肽生物農(nóng)藥，抗旱節(jié)水，營養(yǎng)調(diào)節(jié)為一體，獲更大經(jīng)濟效益，社會效益與環(huán)境效益。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑，每100ml中包括，抗菌肽500-1000單位，吸水劑0-1％，磷礦粉2.5％1065粉2.5％，硫酸鋅1％，甲基纖維4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因抗菌肽用于種子包衣添加劑，按每公斤包衣劑加5000-10000單位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水劑進行種子涂層處理，晾干，再將可作粘著劑用的4％甲基纖維素溶液按40ml拌0.5kg種子的比例充分拌勻，放入包衣機，邊旋轉(zhuǎn)邊加入制衣材料，并不斷稍加(在包衣中)噴水，待種料比1∶(4-5)時即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因抗菌肽用于種子包衣添加劑，按每公斤包衣劑加8000單位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水劑進行芝麻種子凈層處理，晾干，再將4％甲基纖維溶解液粘著劑按40ml拌0.5公斤芝麻種子的比例充分拌勻放入大盆，用棒旋轉(zhuǎn)攪拌使其將種子均勻，不斷加2.5％磷礦粉，2.5％1065粉，1％硫酸鋅，邊加邊噴水，待種料成1∶6即可。
4.轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑，含轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽和種子包衣添加劑可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及種子包衣技術(shù),特別是轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用于種子包衣添加劑。用蠅蛆原料提取,真空冷凍干燥成為基因抗菌肽生物制品,用于種子包衣添加劑,抗農(nóng)作物細菌、病毒和真菌,取代化學農(nóng)藥,它有效殺死真菌蛋白質(zhì),殺菌力強,抗菌譜廣,分子量小,對人、動物和植物無毒、無害、無環(huán)境污染,是符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)要求的環(huán)保型生物農(nóng)藥。
文檔編號A01N59/26GK1312003SQ0110636
公開日2001年9月12日 申請日期2001年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月26日
發(fā)明者茍仕金, 茍鴻鷹, 王成余 申請人:遼寧天成生物制藥研究所