一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人的正常細胞會在數(shù)十次的自然穿傳代后變?yōu)樗ダ霞毎?，而每一次的細胞分裂?使得染色體縮短，引至細胞趨于成熟和老化。而要抑制運種細胞的老化則需要保護染色體 中的端粒。端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，實質(zhì)上是一重復(fù)序列，作用是保持 染色體的完整性。端粒酶是一種由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的核糖核蛋白體，為RNA依賴的DNA聚合 酶，能將端粒片段加至端粒的末端，修復(fù)端粒原有的長度。據(jù)科學(xué)研究把端粒酶注入衰老細 胞中，能夠延長端粒長度，使細胞年輕化。
[0003] 多膚是氨基酸通過膚鍵連接形成的化合物，是機體細胞的主要組成成分。小分子 膚是由二到四個氨基酸組成的具有特定生物活性的膚類總稱。已有報道證實小分子膚具有 修復(fù)端粒末端及延長端粒長度的作用，即具有類似端粒酶的端粒保護作用。因此小分子膚 應(yīng)用于化妝品中可獲得抗皺、抗衰老的良好效果。
[0004] 微生物發(fā)酵與酶解法是目前使用較為廣泛的兩種多膚的制備方法。微生物發(fā)酵法 的產(chǎn)物多為大分子膚，而酶解法也存在酶解效率低、酶用量大、生產(chǎn)成本高等問題。目前已 報道的增加酶解效率的方法主要有兩種:一種是對酶進行改性提高其生物活性和在不良環(huán) 境中的穩(wěn)定性。如小分子化合物結(jié)合在酶上，使蛋白球表面親水化W提高酶的穩(wěn)定性;另一 種是添加助酶解劑，降低酶與反應(yīng)底物間的表面張力。如Seo等人研究發(fā)現(xiàn)Tween 20的加入 可有效增加纖維素與纖維素酶之間的接觸面積，從而提高纖維素酶的利用率，促進木質(zhì)纖 維素的酶解(Bioresource Technology,2011,102:9605-9612)。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵與 酶解相結(jié)合的方法，并W化學(xué)改性酶作為酶解助劑制備大米蛋白，該方法蛋白酶使用量低、 大米蛋白產(chǎn)量高且小分子膚含量高，所得的大米蛋白具有增加端粒長度的功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制 備方法，該方法蛋白酶使用量低、大米蛋白產(chǎn)量高且小分子膚含量高，所得的大米蛋白具有 增加端粒長度的功效。
[0006] -種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制備方法，其特征在于:采用W下步 驟： 1) 將大米經(jīng)粉粹、過濾預(yù)處理后，加水?dāng)埌杈鶆?，配成料液比為大?水=1:1~100的混 合物，所述料液比為g/l; 2) 將步驟1)所得混合物在高壓鍋中在60~120 T的溫度下蒸煮30~60 min; 3) 蒸煮后的混合物降溫至40~60°C，然后添加占混合物質(zhì)量分數(shù)0.1%~10%的地枯草芽 抱桿菌進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度40~60°C，發(fā)酵濕度為50%~90%，發(fā)酵時間為24~72 h，發(fā)酵結(jié)束后 獲取發(fā)酵濾液待用； 4) 將步驟3)所得發(fā)酵濾液置于超聲槽中W5~100K監(jiān)的頻率進行超聲處理，然后加入復(fù) 合蛋白酶溶液，形成酶解液，所述復(fù)合蛋白酶溶液由改性膜蛋白酶溶液、改性木瓜蛋白酶溶 液、PEG-100硬脂酸醋溶液按質(zhì)量比1 a~10:1~10組成； 5) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調(diào)節(jié)步驟4)所得酶解液的抑為6.0~8.0，維持酶解溫度為25~ 50。(：，酶解60~240 min; 6) 酶解結(jié)束后，經(jīng)60~80 T高溫滅酶，既得具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白。
[0007] 復(fù)合蛋白酶溶液的具體制備步驟如下： 所述改性膜蛋白酶溶液通過W下方法制備:在25T下，在抑=6的巧樣酸溶液中，邊攬拌 邊加入天然膜蛋白酶，待其完全溶解后，緩慢加入質(zhì)量為其5倍的二甲基辛二酸亞胺醋，恒 溫反應(yīng)12 h，停止反應(yīng)，得到質(zhì)量分數(shù)為10%的改性膜蛋白酶溶液； 所述改性木瓜蛋白酶溶液通過W下方法制備:在25T下，在抑=6的巧樣酸溶液中，邊攬 拌邊加入天然木瓜蛋白酶，待其完全溶解后，緩慢加入質(zhì)量為其5倍的二甲基辛二酸亞胺 醋，恒溫反應(yīng)12 h，停止反應(yīng)，得到質(zhì)量分數(shù)為10%的改性木瓜蛋白酶溶液； 所述PEG-100硬脂酸醋溶液為質(zhì)量分數(shù)為10%的PEG-100硬脂酸醋水溶液。
[0008] 本發(fā)明使用微生物發(fā)酵與酶解法相結(jié)合，在微生物法將大米蛋白酶解成大分子膚 的基礎(chǔ)上采用酶解法進一步將大分子膚酶解成小分子膚，可W大大降低酶解過程中酶的使 用量。同時在酶解過程中W二甲基辛二酸亞胺醋改性的膜蛋白酶與木瓜蛋白酶代替天然的 蛋白酶，可顯著提高蛋白酶的生物活性和穩(wěn)定性。再者首次將PEG-100硬脂酸醋作為助酶解 劑，用W降低蛋白酶與蛋白質(zhì)之間的表面張力，增加二者之間的接觸面積，從而提高酶解效 率。與傳統(tǒng)的單一酶解法相比，本發(fā)明在較少蛋白酶的使用基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了小分子膚轉(zhuǎn)化的 最大化。
[0009] 采用本發(fā)明方法所提取的小分子膚復(fù)合物中含有二膚β-丙氨酷-心組氨酸、β-丙 氨酸-甲基組氨酸，Ξ膚甘氨酸-k組氨酸-賴氨酸等易于吸收的小分子膚；四膚谷氨酸- k組氨酸-脯氨酸-β-丙氨酷及游離的氨基酸和未分解的蛋白。
[0010] 取實施例1、對比例1、對比例2制備的多膚復(fù)合物，利用高效液相色譜檢測其產(chǎn)物 中小分子膚的含量。結(jié)果顯示為，實施例1微生物發(fā)酵酶解法制得的產(chǎn)物中分子量在100~ 2000化之間的小分子膚含量為7.5 mg/L，對比例1復(fù)合酶解法制得的產(chǎn)物中分子量在100~ 2000化之間的小分子膚含量為1.2 mg/L，對比例2微生物發(fā)酵普通酶解法制得的產(chǎn)物中分 子量在100~2000化之間的小分子膚含量為0.43 mg/L，有效說明本發(fā)明在使用相同蛋白酶 的條件下可獲得較多的小分子膚產(chǎn)物。
[OOW 所述對比例1的多膚的制備方法，采用如下步驟： 1) 將大米經(jīng)粉粹、過濾預(yù)處理后，加水?dāng)埌杈鶆颍涑闪弦罕葹?:80 g/L的酶解原液； 2) 將酶解原液置于超聲槽中W100 KHZ的頻率進行超聲，加入改性膜蛋白酶:改性木瓜 蛋白酶:PEG-100硬脂酸醋質(zhì)量比為1:1:1的復(fù)合蛋白酶溶液； 3) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調(diào)節(jié)酶解液的抑為6.0,維持酶解溫度為35 DC，酶解時間為 240 min; 4) 酶解結(jié)束后經(jīng)80 °C高溫滅酶后的產(chǎn)物，無需進一步提純便可添加至化妝品中進行 使用，其中分子量在100~2000化之間的小分子膚含量為1.2 mg/L。
[0012] 所述對比例2微生物發(fā)酵酶解水解大米蛋白的制備方法，采用如下步驟： 1) 將大米經(jīng)粉粹、過濾預(yù)處理后，加水?dāng)埌杈鶆颍涑闪弦罕葹?:80 g/L的發(fā)酵原液； 2) 將發(fā)酵原液置于高壓鍋中W100 T的溫度蒸煮30 min; 3) 蒸煮后的發(fā)酵原液降溫至60T后，接入原料比例10%的地枯草芽抱桿菌，維持發(fā)酵溫 度為60T，發(fā)酵濕度為80%，發(fā)酵時間為64 h，發(fā)酵結(jié)束后過濾取濾液待用； 4) 將步驟3)獲得的濾液置于超聲槽中W100 K監(jiān)的頻率進行超聲，加入天然膜蛋白酶： 天然木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1:10的復(fù)合天然蛋白酶溶液； 5) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調(diào)節(jié)酶解液的抑為6.0,維持酶解溫度為35 DC，酶解時間為 240 min； 6) 酶解結(jié)束后經(jīng)80 °C高溫滅酶后的產(chǎn)物，無需進一步提純便可添加至化妝品中進行 使用，其中分子量在100~2000化之間的小分子膚含量為0.43 mg/L。
[0013] 使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法來測量小分子膚對端粒長度的促增長作用。 選取5例健康人外周血樣本，每例兩份血樣，共10份，分為兩組a組(未加小分子膚的樣品巧 份和b組(加入實施例1的小分子膚樣品巧份，用端粒長度擴增引物對樣品進行PCR擴增，經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳后得到DNA基因片段。最后采用PCR法測量端粒長度相對T/S(端粒/單拷貝） 比率，而T/S比率同端粒的平均長度呈正比關(guān)系，故端粒長度可根據(jù)T/S比值來確定。測試結(jié) 果如表1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，b組的T/S比值比a組高了 35%，說明小分子膚有增加端粒長度的效 果，具有與端粒酶相似的保護、穩(wěn)定端粒的作用。
[0014] 表1小分子膚對端粒長度T/S比值的影響
將實施例1中的小分子膚復(fù)合物W1%的比例加入乳液中，通過測試人體皮膚彈性的變~ 化檢測其抗衰老效果。皮膚真皮層中的膠原纖維、彈力纖維W及填充于細胞間的氨基聚糖、 蛋白多糖與結(jié)合水W-定的排列組合方式賦予了皮膚彈性，皮膚彈性越好表明皮膚越年 輕，彈性是化妝品抗衰老功效評價的重要參數(shù)。
[0015] 具體方法如下:測試樣品為添加1%小分子膚成分的乳液和不添加小分子膚成分的 乳液。測試點標(biāo)記:在每位受試者的左右前臂內(nèi)側(cè)用模具標(biāo)記測試區(qū)域(4 cm*6 cm),模具 上挖有桐孔，在桐孔邊標(biāo)記各個測試探頭的測試點位置。樣品按2.0±0.1 mg/cm2的用量， 均勻涂于試驗區(qū)，每種樣品隨機選用受試者8名。通過皮膚彈性測試儀MPA580測定受試者前 臂內(nèi)側(cè)標(biāo)記點使用樣品前、使用樣品15 d，30 d后的皮膚彈性變化如圖1、圖2所示。從中可 W看出，添加小分子膚的產(chǎn)品使用后對皮膚的彈