一種立克次體多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及PCR檢測(cè)領(lǐng)域，更具體的說是設(shè)及一種立克次體多重巧光PCR檢測(cè)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 立克次體，是一種原核微生物，細(xì)胞多為球桿形，大小介于細(xì)菌和病毒之間，在真 核細(xì)胞內(nèi)營專性寄生(除個(gè)別外）。在自然界中主要在曬齒類動(dòng)物（鼠類)和家畜（牛、羊、犬） 等膽存宿主內(nèi)繁殖。風(fēng)、圣、婢、蛾等吸血節(jié)肢動(dòng)物為主要傳播媒介。
[0003] 立克次體引起的立克次體病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性傳 染病。立克次體病的主要臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、頭痛、全身不適和皮疹(Q熱除外）等非特異臨床 癥狀，呈急性表現(xiàn)。由于缺乏典型臨床表現(xiàn)，極易誤診為病毒類疾病和不明原因發(fā)熱，而且 各種立克次體對(duì)臨床常用抗生素如抗細(xì)菌類青、鏈霉素，抗病毒類抗生素普遍不敏感，易導(dǎo) 致病情加重，延誤治療。因此建立立克次體病快速準(zhǔn)確的診斷方法尤為必要。然而，立克次 體營養(yǎng)要求較高、難W培養(yǎng)，通常需要細(xì)胞及組織培養(yǎng)，給其實(shí)驗(yàn)室診斷帶來一定的困難。 目前實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括血清學(xué)、病原學(xué)和分子生物學(xué)。血清學(xué)診斷在發(fā)病一周內(nèi)往往檢 測(cè)不到抗體，不能用于早期診斷;而病原學(xué)診斷操作復(fù)雜，其分離率較低；目前基于PCR檢測(cè) 技術(shù)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法是最常用的特異快速早期診斷依據(jù)。
[0004] 巧光PCR技術(shù)作為一種高靈敏度、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到廣泛 應(yīng)用，尤其是在立克次體檢測(cè)方面成為快速檢測(cè)、確診的有效工具，但在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，當(dāng) 樣品量非常大時(shí)，單重巧光PCR在成本和時(shí)間方面就存在一定的劣勢(shì)，迫切需要一種高通 量、低成本、高效率的方法來進(jìn)行批量的快速檢測(cè)。為了克服單重巧光PCR的不足，同時(shí)采用 多對(duì)引物擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)模板的多重巧光PCR應(yīng)運(yùn)而生。
[0005] 多重PCR的優(yōu)點(diǎn)：（1)高效性，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原菌或?qū)Χ鄠€(gè)目的 基因進(jìn)行擴(kuò)增分析；（2)系統(tǒng)性，多重PCR很適宜對(duì)癥狀相同或易污染相同食品的一組病原 菌進(jìn)行分析；（3)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原菌在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢出，將大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間 和試劑，為臨床或食品安全檢測(cè)提供更多更準(zhǔn)確的信息;相對(duì)于單重巧光PCR，多重巧光PCR 必須保證其靈敏度不低于單重巧光PCR的水平;避免各個(gè)引物對(duì)之間的相互干擾和各目的 片段之間的非特異性擴(kuò)增；引物和探針都要有相近的退火溫度，使各目的片段有相近的擴(kuò) 增效率;還要保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的巧光基團(tuán)間無相互干擾，W及巧光PCR儀有相應(yīng)的多個(gè) 檢測(cè)通道。
[0006] 綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中，立克次體的傳統(tǒng)檢測(cè)方式存在著檢測(cè)慢、診斷操作復(fù)雜的 劣勢(shì);單重巧光PCR在成本和時(shí)間方面就存在一定的劣勢(shì)；多重PCR雖然是快速檢測(cè)病原體 的有效手段，但因?yàn)橐锾结樀脑O(shè)計(jì)、反應(yīng)體系的探索、質(zhì)控的構(gòu)建等諸多因素導(dǎo)致PCR靈 敏度、穩(wěn)定性和特異性降低，造成檢測(cè)結(jié)果的誤差，所W難W在臨床、檢驗(yàn)確診領(lǐng)域推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種立克次體多重巧光PCR檢測(cè)方法，擬將多重PCR方法和巧光定量方 法相結(jié)合，解決多重PCR檢測(cè)的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性差的問題，克服單重巧光PCR在成本 和時(shí)間方面存在的劣勢(shì)，使得PCR檢測(cè)既能同時(shí)診斷多種常見的立克次體病原體，又滿足流 行病學(xué)調(diào)查和快速檢驗(yàn)的需求。
[0008] 為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案： 一種立克次體多重巧光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1) 提取DNA; (2) 設(shè)計(jì)引物和巧光探針，根據(jù)TaqMan巧光探針PCR檢測(cè)方法，確定引物和巧光探針 的設(shè)計(jì)原則，分析Q熱立克次體、普氏立克次體、莫氏立克次體基因的序列，針對(duì)每種病原體 各設(shè)計(jì)Ξ組引物和探針，探針分別標(biāo)記不同染料，其中Q熱立克次體探針巧光基團(tuán)為FAM，巧 滅基團(tuán)為BHQ1;普氏立克次體探針巧光基團(tuán)為皿X，巧滅基團(tuán)為B冊(cè)1;莫氏立克次體探針巧 光基團(tuán)為化lRed610，巧滅基團(tuán)為B冊(cè)2;設(shè)計(jì)的引物探針分別命名為： Q-F1--Q-R1--Q-P1 Q-F2--Q-R2--Q-P2 Q-F3--Q-R3--Q-P3 PR0W-F1 --PR0W-R1 --PR0W-P1 PR0W-F2--PR0W-R2--PR0W-P2 PR0W-F3--PR0W-R3--PR0W-P3 TYPHI-F1 --TYPHI-R1 --TYPHI-P1 TYPHI-F2--TYPHI-R2--TYPHI-P2 TYPHI-F3--TYPHI-R3--TYPHI-P3 (3) 合成陽物對(duì)照品：化學(xué)合成含目的擴(kuò)增片段序列的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照品，將合成 的產(chǎn)物分別命名為 Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3;PR0W-Z1、PR0W-Z2、PR0W-Z3;TYPHI-Z1、TYPHI-Z2、 TYPHI-Z3，分別對(duì)應(yīng)每種病原體的Ξ組引物探針； (4) 配制陽物對(duì)照品：將Q-Z1按100000倍稀釋后作為陽性對(duì)照品，標(biāo)記為Q-Z11，取Q- Z11稀釋10倍，得到Q-Z12;再取Q-Z12稀釋10倍，得到Q-Z13;再取Q-Z13稀釋10倍，得到Q- Z14； 按照上面的稀釋方法分別將 Q-Z1、Q-Z2、Q-Z3 ;PR0W-Z1、PR0W-Z2、PR0W-Z3 ;TYPHI-Z1、 TYPHI-Z2、TYPHI-Z3 分別稀釋成： Q-Z11、Q-Z12、Q-Z13、Q-Z14 Q-Z21、Q-Z22、Q-Z23、Q-Z24 Q-Z31、Q-Z32、Q-Z33、Q-Z：M PROW-Z11、PROW-Z12、PROW-Z13、PROW-Z14 PR0W-Z21、PR0W-Z22、PR0W-Z23、PR0W-Z24 PR0W-Z31、PR0W-Z32、PR0W-Z33、PR0W-Z34 TYPHI-Z11、TYPHI-Z12、TYPHI-Z13、TYPHI-Z14 TYPHI-Z21、TYPHI-Z22、TYPHI-Z23、TYPHI-Z24 TYPHI-Z31、TYPHI-Z32、TYPHI-Z33、TYPHI-Z：M 巧）選擇引物和巧光探針，用每個(gè)病原體的Ξ組引物和探針分別擴(kuò)增各自對(duì)應(yīng)的稀釋 好的陽性對(duì)照品，觀察它們擴(kuò)增的能力來確定最佳引物探針組;取稀釋的Ξ組質(zhì)粒分別作 為各自對(duì)應(yīng)引物探針檢測(cè)的樣品，每組各濃度樣本重復(fù)2次； (6)對(duì)多重巧光PCR檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，最初的巧光PCR檢測(cè)體系為40化體系，最初的巧 光PCR檢測(cè)循環(huán)參數(shù)設(shè)置為:94°C X 2min，1個(gè)循環(huán);94°C X 15s一60°C X Imin(巧光采集），40 個(gè)循環(huán)；;1)優(yōu)化探針用量，根據(jù)基本巧光PCR體系的擴(kuò)增情況，對(duì)探針的用量進(jìn)行調(diào)整，分 別選擇每條探針(20μΜ)體積0.化L、0.化L、0.05化進(jìn)行優(yōu)化，W對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒作為檢測(cè)樣本， 每組樣本重復(fù)2次;惡Η尤化Mgh用量，根據(jù)基本巧光PCR體系的擴(kuò)增情況，對(duì)Mgh的用量進(jìn) 行調(diào)整，分別選擇MgCl2(25 ml) 5化、化L、3.2化進(jìn)行優(yōu)化；蠻;優(yōu)化反應(yīng)條件，根據(jù)引物和探 針的退火溫度，分別選擇58°C、60°C、62°C進(jìn)行優(yōu)化。
[0009] (7)對(duì)多重巧光PCR反應(yīng)體系的方法學(xué)驗(yàn)證，①靈敏度驗(yàn)證，將約為lOcopies/mL 質(zhì)粒原液分別稀釋成105、104、5X103、103、5X10 2濃度，經(jīng)優(yōu)化好的體系確定該檢測(cè)方法的 靈敏度，且每組各濃度樣本重復(fù)2次;②穩(wěn)定性驗(yàn)證，選擇合適的質(zhì)粒濃度重復(fù)10次進(jìn)行穩(wěn) 定性驗(yàn)證;③特異性驗(yàn)證，WQ熱立克次體、普氏立克次體、莫氏立克次體、±拉熱弗朗西絲 菌、鼠疫耶爾森氏菌EV76株DNA為模板進(jìn)行特異性驗(yàn)證;④模擬標(biāo)本驗(yàn)證，W不攜帶立克次 體的鼠體標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，將添加質(zhì)粒的鼠體標(biāo)本和不加質(zhì)粒的鼠體標(biāo)本作為對(duì)照，同 時(shí)提取DNA進(jìn)行檢測(cè)。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： (1) 建立了流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、Q熱巧巾立克次體多重實(shí)時(shí)巧光定量PCR 方法； (2) 明顯提高了 Ξ種立克次體檢測(cè)的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性，大大縮短Ξ種立克次體 病原體的檢測(cè)周期； (3) 確定了 Q熱立克次體、普氏立克次體、莫氏立克次體Ξ重巧光PCR檢測(cè)方法的基本體 系和流程。
【附圖說明】
[0011] 圖巧組1的Q熱立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖2為組2的Q熱立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖3為組3的Q熱立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖4為組4的普氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖5為組5的普氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖6為組6的普氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖7為組7的莫氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖8為組8的莫氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖9為組9的莫氏立克次體引物和巧光探針檢測(cè)結(jié)果圖； 圖10為Ξ種立克次體探針用量?jī)?yōu)化檢測(cè)結(jié)果圖； 圖11為Ξ種立克次體Mgh用量?jī)?yōu)化檢測(cè)結(jié)果圖； 圖12為反應(yīng)條件1的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果圖； 圖13為反應(yīng)條件2的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果圖； 圖14為反應(yīng)條件3的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果圖； 圖15為Q熱立克次體靈敏度驗(yàn)證結(jié)果圖； 圖16為普氏立克次體靈敏度驗(yàn)證結(jié)果圖； 圖17為莫氏立克次體靈敏度驗(yàn)證結(jié)果圖； 圖18為Ξ重巧光PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果圖； 圖19為模擬標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果圖；
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明的應(yīng)用原理、作用與功效，通過如下實(shí)施方式予W說明。
[0013] 實(shí)施例1 本發(fā)明提供的一種立克次體多重巧光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1) 提取DNA，采用經(jīng)典的酪-氯仿法提取DNA，具體步驟如下： ① 取適量動(dòng)物組織放入0.5血離屯、管中，置于200 μL TE緩沖液中窩旋震蕩、離屯、、棄 上清;再加入200 μL ΤΕ浸泡化~3 hW去除乙醇的影響(新鮮樣品不需浸泡；2年W上標(biāo)本 浸泡過夜）、離屯、、棄上清； ② 加入10 μL STE+PK溶液，用燒烙的槍頭研磨至溶液狀態(tài)，再加190 μΚ標(biāo)本量大時(shí)加 390 pL)STE+PK溶液，混勻W分離組織;將