實時熒光pcr檢測貉子源性成分的引物探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物、探針及具體檢測方法，具有良好的靈敏性和特異性，采用實時熒光PCR特異擴增法可以定性分析畜肉食品中是否含有貉子源性成分,發(fā)揮了實時熒光PCR檢測技術的優(yōu)點,進一步完善了食品檢測體系,加大對消費者利益的保護力度。
【專利說明】實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針及方法
[0001]【技術領域】:
本發(fā)明屬食品檢驗【技術領域】，確切地說是一種實時熒光PCR檢測用引物，探針以及利用該引物探針，及對貉子源性成分進行鑒別檢測的方法。
【背景技術】[0002]目前，國內外應用于檢測食品和飼料中所含動物成分的技術主要有二種:ELISA方法及PCR特異擴增法，在實際檢測中應用最多的是PCR特異擴增法，PCR特異擴增法又有普通定性PCR，實時熒光PCR。實時熒光PCR技術是基于普通PCR技術基礎上發(fā)展而來的，在擴增反應體系中添加一個特異性的熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，即檢測靶核昔酸序列擴增狀態(tài)，以進行結果判定"它的主要優(yōu)點是:(I)在閉管狀態(tài)下進行擴增產(chǎn)物檢測，無需PCR產(chǎn)物的后處理，避免了擴增產(chǎn)物污染而致的假陽性，保證了結果的可靠性；(2)探針雜交特異性更強，靈敏度更高，在普通PCR擴增的基礎上又多了一條可以與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，熒光信號由儀器自動收集，進一步提高了靈敏度；(3)無需酶切位點存在，無需進行酶切，電泳，節(jié)省了時間，PCR后無需后續(xù)處理，操作更簡單快速；
在動物產(chǎn)品原料和加工產(chǎn)品中，經(jīng)常出現(xiàn)動物成分的摻假造假和無意污染現(xiàn)象，摻假主要是不法商要降低成本或增加品質，以謀取巨額的經(jīng)濟利益，在食品和飼料的加工過程中，以低價格的原料替代高價格的原料或摻入到高價格的原料中，這是一種欺詐行為"摻假造假的欺詐行為，被我國多部法律法規(guī)禁止〃。貉子作為一種毛皮動物，在殺完去皮張之后，往往將耗子肉賤賣給不法商販，不法商販往往某些價格較高的畜肉制品中卻添加有貉子肉，以次充好。由于沒有相應的引物、探針，迄今為止還沒有對畜肉食品中貉子源性成分的定性檢測方法，以至于不能及時發(fā)現(xiàn)畜肉食品中貉子源性成分的存在，這種摻假造假，以次充好的行為除了影響影響人體健康、嚴重損害了消費者的利益。
[0003]目前我國還沒有相應方法對食品和飼料中的貓源性成分進行檢測〃也就是說，食品和飼料中的貉子源性成分檢測仍處于空白狀態(tài)"建立食品和飼料中貉子源性成分檢測方法，對于打擊假冒偽劣食品，保障消費者權益和身體健康，保護我國畜牧業(yè)安全和經(jīng)濟利益，避免國際貿易糾紛等方面具有十分重要的意義，是迫在眉睫要解決的食品安全問題和檢驗檢疫問題。綜上所述，鑒于目前尚沒有快速簡便地檢測和鑒定貉子源性成分的檢測技術，因此，本領域迫切需要開發(fā)新的快速簡便地檢測和鑒定貉子源性成分的技術。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針及方法。
[0005]實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針，分別為:
上游引物 Pl:CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC
下游引物 P2:GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA帶有熒光染料的探針序列為:CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC 所述的突光染料，5'端為FAM標記,3' eclipse標記。
[0006]實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其步驟如下:
a.提取待檢樣品基因組DNA;
b.以所提取的DNA作為模板，加入上述引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應，記錄樣品反應的Ct值；
所述的實時熒光PCR反應體系為:
2X Real-time PCR 預混液 ΙΟμ? 上游引物(10 Mmol/L) Iμ? 下游引物(10 Mmol/L) ?μ? 探針(10 Mmol/L) Iμ?
樣品 DNA(I -100 ng/μ? 2μ? ddH205μ?
所述的實時熒光PCR反應條件為95°C IOmin, I個循環(huán)；95°C，15s，60°C 30s，40個循環(huán)， 所述的實時熒光PCR方法還設有空白對照、陰性對照、陽性對照，判定標準為:
空白對照:以ddH20為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值大于或等于40;
陰性對照:以非貉子源性物種基因組DNA為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值大于或等于40;
陽性對照:以貉子基因組DNA為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值小于或等于34;
待測樣品貉子源性基因檢測Ct值大于或等于40，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品未檢出貉子源性基因；待測樣品貉子源性基因檢測Ct值小于或等于36，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品檢出貉子源性基因；待測樣品貉子源性基因檢測Ct值在36-40之間，重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后結果Ct值大于400且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品未檢出貉子源性基因；再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品檢出貉子源性基因。
[0007]本發(fā)明提供了一種實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物、探針及具體檢測方法，具有良好的靈敏性和特異性，采用實時熒光PCR特異擴增法可以定性分析畜肉食品中是否含有貉子源性成分，發(fā)揮了實時熒光PCR檢測技術的優(yōu)點，進一步完善了食品檢測體系，加大對消費者利益的保護力度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是本發(fā)明實施例1檢測貉子源性成分陽性樣品的熒光PCR擴增圖；其中，I為絡子肉制品；2，3為絡子肉制品；
圖2是本發(fā)明實施例2檢測貉子源性成分陽性樣品的熒光PCR擴增圖；其中，I為貉子肉制品；2為絡子肉制品。
[0009]【具體實施方式】:實施例1
1.所用引物和探針:
選擇貉子線粒體d-loop基因作為對象，設計并合成實時熒光PCR特異性擴增引物和探針；
實時熒光PCR引物和探針序列包括:
上游引物 P1: CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC;
下游引物 P2: GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA;
探針:CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC,該探針的5.端用報告熒光染料FAM標記，3.端用淬滅熒光染料eclipse標記。
[0010]2.樣品DNA的提取與純化按以下步驟進行:
a.將含貉子源性成分的肉樣品用組織勻漿器將樣品打成勻漿，
取IOOmg勻漿加入1.0 mL CTAB裂解液及50 μ?蛋白酶K溶液，渦旋震蕩30 s后，顛倒混合5次，65 1:水浴過夜(12h-16h)。室溫12 000 r/min離心10 min，取上層溶液800μ?,加入等體積的Tris飽和酚/三氯甲烷/異戊醇，輕輕顛倒離心管混勻，室溫12 000 r/min離心10 min ;取上層清液(水相)于一新離心管中，加入等體積的三氯甲烷，顛倒混勻，室溫12 000 r/min離心10 min，取上清液600 μ?。將上清液移至一新離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4 °C靜置30 min ,4 °C, 12 000 r/min離心10 min,小心棄去上清液，向沉淀加入500 μ? 70%冷乙醇，洗滌沉淀，4 °C，12 000 r/min離心5 min，小心倒出上清液，室溫干燥后，將DNA溶于200 PL去離子水中，-20 ℃保存。
也可使用等效的商品化試劑盒提取模板DNA。
[0011]3.建立實時熒光PCR擴增反應體系 實時熒光PCR反應體系見表I
表I 實時熒光PCR反應體系
【權利要求】
1.實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針，分別為:
上游引物 Pl:CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC ；
下游引物 P2:GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA ； 帶有熒光染料的探針序列為:CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC。
2.根據(jù)權利要求1所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針，其特征在于:所述的突光染料，5'端為FAM標記,3' eclipse標記。
3.實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其步驟如下: a.提取待檢樣品基因組DNA； b.以所提取的DNA作為模板，加入權利要求1所述的引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應，記錄樣品反應的Ct值。
4.根據(jù)權利要求3所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于:所述的實時熒光PCR反應體系為:
2 X Real-time PCR 預混液 ΙΟμ?， 上游引物(10 Mmol/L) ?μ?, 下游引物(10 Mmol/L) ?μ?, 探針(10 Mmol/L)?μ?, 樣品 DNA(I ~100 ng/ L) 2μ?, ddH205μ?。
5.根據(jù)權利要求4所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于:所述的實時熒光PCR反應條件為95°C IOmin, I個循環(huán)；95°C，15s，60°C 30s, 40個循環(huán)。
6.根據(jù)權利要求3、4或5所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于:所述的實時熒光PCR方法還設有空白對照、陰性對照、陽性對照，判定標準為: 空白對照:以ddH20為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值大于或等于40; 陰性對照:以非貉子源性物種基因組DNA為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值大于或等于40; 陽性對照:以貉子基因組DNA為模板，按照b和c所述條件，進行實時熒光PCR反應，檢測Ct值小于或等于34; 待測樣品貉子源性基因檢測Ct值大于或等于40，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品未檢出貉子源性基因；待測樣品貉子源性基因檢測Ct值小于或等于`36，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品檢出貉子源性基因；待測樣品貉子源性基因檢測Ct值在36-40之間，重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后結果Ct值大于400且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品未檢出貉子源性基因；再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品檢出貉子源性基因。
【文檔編號】G01N21/64GK103451304SQ201310418647
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權日:2013年9月16日
【發(fā)明者】劉金華, 史艷宇, 劉韜, 孟日增, 聶丹丹 申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局