利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生命活動的載體，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是決定其生理功能的重要前提。目前，獲取 高質(zhì)量的單晶是利用X-射線衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)精細三維結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，也是此技術(shù)的瓶頸 問題。如何篩選得到蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件是獲得高質(zhì)量蛋白質(zhì)單晶的第一步，然而，從高純蛋 白質(zhì)到獲得衍射質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體的成功率不足20%，因此，提高蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶成功 率迫在眉睫。
[0003] 用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率的方法有很多種，包括共結(jié)晶、改善界面、控制變 溫方式、軒晶法等。文獻1: "An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization[J].Acta Crystallographica Section D,2007,63(4):550-554."報道了籽晶法可以使蛋白質(zhì)的結(jié)晶成功率提高2.5~65倍；文獻2: "Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase[J]·Acta Crystallographica Section D,2004,60(3):601-605"報道了利用低分辨率的蛋白質(zhì)晶體 作為籽晶優(yōu)化蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件，可以獲得高分辨率的蛋白質(zhì)晶體，進而獲取衍射數(shù)據(jù)。然 而，該方法制備的籽晶溶于水和有機溶劑，只能使用一次，成本昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用交聯(lián)的蛋白質(zhì)晶體作為籽晶用于 蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，利用交聯(lián)劑對常規(guī)方法制備的蛋白質(zhì)晶體進行交聯(lián)，得到可在空氣穩(wěn) 定存在的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體。然后利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，可以有效地提高蛋白質(zhì)結(jié) 晶條件篩選的成功率。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：首先制備交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體籽晶溶 液，然后把籽晶溶液滴加在結(jié)晶板上，最后進行蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的篩選。具體步驟如下：
[0006] 第一步，生長蛋白質(zhì)晶體，并對蛋白質(zhì)晶體進行化學(xué)交聯(lián)，將得到的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶 體溶于超純水中，濃度均為5_20mg/ml，制得籽晶溶液；
[0007] 第二步，在結(jié)晶板的每個坐滴孔中滴入0.5-2μ1的籽晶溶液，自然晾干結(jié)晶板；
[0008] 第三步，利用Index?篩選試劑盒對蛋白質(zhì)進行結(jié)晶條件篩選，首先制備蛋白質(zhì)溶 液;然后向結(jié)晶板的每個深孔中加入80μ1的池液，將篩選結(jié)晶劑和蛋白質(zhì)溶液按照1:1的質(zhì) 量比混合得到結(jié)晶溶液，將2μ1的結(jié)晶液滴滴入結(jié)晶板的坐滴孔，密封結(jié)晶板，并在277-293Κ的結(jié)晶溫度下結(jié)晶3-7天；
[0009] 第四步，觀察蛋白質(zhì)晶體的形貌，統(tǒng)計蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶條件數(shù);收集并衍射蛋白 質(zhì)晶體，獲取衍射數(shù)據(jù)。
[0010] 所述的籽晶溶液選用交聯(lián)溶菌酶作為籽晶。
[0011] 所述的籽晶溶液選用質(zhì)量比為1:1的交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作為籽晶。
[0012] 所述的軒晶溶液選用質(zhì)量比為1:1:1:1:1的交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氛酶、蛋白質(zhì) 酶K、奇異果甜蛋白質(zhì)和糜蛋白酶原A II晶體作為籽晶。
[0013] 所述的化學(xué)交聯(lián)過程中把結(jié)晶母液全部置換成交聯(lián)溶液。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：
[0015] 1、本發(fā)明選取交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，可以在空氣中穩(wěn)定存在，利于長期存儲， 并且可以重復(fù)利用；
[0016] 2、本發(fā)明結(jié)合使用分子量和晶格常數(shù)差異比較大的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，覆 蓋了大部分可結(jié)晶蛋白質(zhì)的分子量和晶格常數(shù)，可以對蛋白質(zhì)結(jié)晶起到很好的誘導(dǎo)作用， 增加了蛋白質(zhì)結(jié)晶的可能性；
[0017] 3、本發(fā)明可以為提尚蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率提供一種有效的方法。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實施例。
[0019] 本發(fā)明提出一種將交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率的 方法。具體的技術(shù)方案主要包括兩個方面:1、制備交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體;2、利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體 作為籽晶篩選蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶成功率。
[0020] 1.制備籽晶
[0021]交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體的制備主要包括兩個步驟：（1)蛋白質(zhì)的結(jié)晶；（2)晶體的化學(xué)交 聯(lián)。第一步:蛋白質(zhì)的結(jié)晶。從同一沉淀劑中吸取80μ1的池液加入40孔板的每個孔中。將蛋 白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液按1 : 1混合制備得到結(jié)晶溶液，然后吸取2μ1的溶液滴加到蓋玻片 上，作為蛋白質(zhì)結(jié)晶懸滴，將蓋玻片翻轉(zhuǎn)蓋到40孔板上。將40孔板放入到控溫箱里在293Κ下 孵育2天，制備得到蛋白質(zhì)晶體。第二步：晶體的化學(xué)交聯(lián)。將蛋白質(zhì)晶體收集到5ml的ΕΡ管 中，加入交聯(lián)劑對晶體進行化學(xué)交聯(lián)。1天后，吸走交聯(lián)劑溶液，并用超純水把晶體洗干凈。 本發(fā)明制備的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體包括:交聯(lián)溶菌酶、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異果甜蛋白 質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體。本發(fā)明所用的籽晶主要包括三類：1、選用交聯(lián)溶菌酶作為籽晶； 2、選用交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作為籽晶，其質(zhì)量比為1:1; 3、選用交聯(lián)溶菌酶晶體、 過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體作為籽晶，其質(zhì)量比為1:1: 1:1:1。實驗中，將籽晶溶入超純水中，配制成濃度為5-20mg/ml的籽晶溶液。
[0022] 2.利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶篩選蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶成功率
[0023]首先，吸取0.5_2μ1步驟1得到的籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴孔，自然晾干結(jié)晶板。 然后，利用自動移液系統(tǒng)向結(jié)晶板的每個坐滴孔中加入2μ1的蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液，將 結(jié)晶板放入到控溫箱，結(jié)晶溫度為2 7 7 - 2 9 3 Κ，結(jié)晶時間為3 - 7天。本發(fā)明選用H a m p t ο η Research公司貨號為No. HR2-134的Index?篩選試劑盒，結(jié)晶實驗采用坐滴法。用20種蛋白 質(zhì)進行結(jié)晶篩選實驗，觀察統(tǒng)計其篩選結(jié)果，并驗證20種蛋白質(zhì)的結(jié)晶成功率;通過對晶體 的收集、冷凍、衍射分析等步驟，得到蛋白質(zhì)晶體的衍射數(shù)據(jù)。
[0024] 具體步驟如下：
[0025]第一步:制備交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體，包括生長蛋白質(zhì)晶體以及對晶體進行化學(xué)交聯(lián)。在 交聯(lián)反應(yīng)中需要把結(jié)晶母液全部置換成交聯(lián)溶液，避免結(jié)晶母液中未反應(yīng)的蛋白質(zhì)與交聯(lián) 劑反應(yīng)生成絮狀物沉淀;然后把交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體溶于超純水中，其濃度均為5-20mg/ml，制 得籽晶溶液；
[0026]第二步:吸取0.5_2μ1的籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴孔，自然晾干結(jié)晶板；
[0027]第三步:利用Index?篩選試劑盒對蛋白質(zhì)進行結(jié)晶條件篩選。首先制備蛋白質(zhì)溶 液;然后向結(jié)晶板的每個深孔中加入80μ1的池液，使用自動移液系統(tǒng)將2μ1的結(jié)晶液滴(篩 選結(jié)晶劑和蛋白質(zhì)溶液1:1混合)滴在實驗組的坐滴孔中，用結(jié)晶膠帶密封結(jié)晶板。然后把 結(jié)晶板都放置在溫控箱中，結(jié)晶溫度為277-293Κ，結(jié)晶時間為3-7天；
[0028] 第四步:利用自動拍照系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)晶體的形貌，并統(tǒng)計蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶條 件數(shù);收集并衍射蛋白質(zhì)晶體，獲取衍射數(shù)據(jù)。
[0029] 下面用幾種蛋白質(zhì)的結(jié)晶實驗來驗證交聯(lián)溶菌酶晶體作為籽晶的效果，以不加籽 晶作為對照組。
[0030] 實施例1:利用交聯(lián)溶菌酶晶體作為籽晶對溶菌酶進行結(jié)晶條件的篩選，對照組不 做任何處理。
[0031] 第一步：吸取0.5μ1濃度為5mg/ml的交聯(lián)溶菌酶晶體籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴 孔，作為實驗組，自然晾干結(jié)晶板。對照組的結(jié)晶板不做任何處理。
[0032] 第二步：將購自日本Seikagaku公司的N0.100940的六次重結(jié)晶溶菌酶溶于pH為 4.6，濃度為0.1 Μ的醋酸鈉緩沖液中，其初始濃度為20mg/ml，即得到溶菌酶結(jié)晶溶液。 [0033]第三步:利用Index?篩選試劑盒對溶菌酶進行結(jié)晶條件篩選。本實驗采用坐滴法， 向結(jié)晶板的每個深孔中加入80μ1的池液，使用自動移液系統(tǒng)將2μ1的結(jié)晶液滴(篩選結(jié)晶劑 和溶菌酶溶液1:1混合)滴在實驗組的坐滴孔中，用結(jié)晶膠帶密封結(jié)晶板。以同樣方法把結(jié) 晶液滴加在對照組的坐滴孔中。
[0034] 第四步:將實驗組和對照組的結(jié)晶板都放置在277Κ溫控箱中，結(jié)晶時間為3天，利