用自動顯微拍照系統(tǒng)觀察溶菌酶晶體的形貌，并統(tǒng)計溶菌酶的結(jié)晶條件數(shù)。
[0035] 第五步:收集并凍存蛋白質(zhì)晶體，利用家用X-射線衍射儀進行晶體的衍射，收集并 分析衍射數(shù)據(jù)。經(jīng)過統(tǒng)計與分析，得到結(jié)果如下:通過X-射線衍射實驗驗證了上述晶體為溶 菌酶蛋白晶體，其宏觀上可以產(chǎn)生X-射線衍射現(xiàn)象，衍射的分辨率為1.3 Α。其中實驗組溶 菌酶的結(jié)晶條件數(shù)目為80,與對照組(結(jié)晶數(shù)為40)相比，以交聯(lián)溶菌酶晶體作為籽晶的篩 選成功率有大幅度地提尚。
[0036] 實施例2:利用交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作為籽晶對蛋白酶Κ進行結(jié)晶條件篩 選，對照組選用交聯(lián)的溶菌酶晶體作籽晶。
[0037]第一步:吸取ΙμL濃度為10mg/ml的交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體籽晶溶液滴入結(jié) 晶板的坐滴孔作為實驗組，對照組中加入1 μ 1濃度為10 m g /m 1的交聯(lián)溶菌酶晶體，自然晾干 結(jié)晶板。
[0038] 第二步:將美國Sigma公司的No. P6556蛋白酶K，溶于pH為4.60，濃度為0.08M醋酸 鎂，0.05M二甲砷酸鈉的緩沖液中，其初始濃度為20mg/ml，即得到蛋白質(zhì)酶K結(jié)晶溶液。 [0039]第三步:利用Index?篩選試劑盒對蛋白酶K進行結(jié)晶條件篩選。本實驗采用坐滴 法，向結(jié)晶板的每個深孔中加入80μ1的池液，使用自動移液系統(tǒng)將2μ1的結(jié)晶液滴(篩選結(jié) 晶劑和蛋白酶Κ溶液1:1混合)滴在實驗組的坐滴孔中，用結(jié)晶膠帶密封結(jié)晶板。以同樣方法 把結(jié)晶液滴加在對照組的坐滴孔中。
[0040]第四步:將實驗組和對照組的結(jié)晶板都放置在溫控箱中，結(jié)晶溫度為293Κ，結(jié)晶時 間7天，利用自動顯微拍照系統(tǒng)觀察蛋白酶K晶體的形貌，并統(tǒng)計晶體的條件數(shù)目。
[0041] 第五步:收集并凍存蛋白質(zhì)晶體，利用家用X-射線衍射儀進行晶體的衍射，收集并 分析衍射數(shù)據(jù)。經(jīng)過觀察與統(tǒng)計，得到結(jié)果如下:通過X-射線衍射實驗驗證了上述晶體為蛋 白酶Κ晶體，其宏觀上可以產(chǎn)生X-射線衍射現(xiàn)象，衍射的分辨率為1.45 Aw其中實驗組蛋白 質(zhì)的結(jié)晶條件數(shù)目為54,與對照組(結(jié)晶數(shù)為26)相比，以交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作 為籽晶的篩選成功率遠遠大于僅以交聯(lián)溶菌酶作為籽晶的成功率。
[0042] 實施例3:利用交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白 酶原A II晶體作為籽晶對過氧化氫酶進行結(jié)晶條件篩選，對照組選用交聯(lián)溶菌酶和過氧化 氫酶晶體作為籽晶。
[0043]第一步:吸取2μ1濃度為15mg/ml的交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異 果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴孔，作為實驗組，對照組的結(jié) 晶板中加入2 μ 1濃度為15 m g / m 1的交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作為籽晶，自然晾干結(jié)晶 板。
[0044] 第二步：將美國Sigma公司生產(chǎn)的No. C40過氧化氫酶，溶于pH為7.00，濃度為0.1 M 的丁乙酸緩沖液中，其初始濃度為12mg/ml，用0.22μπι的無菌濾膜過濾除去雜質(zhì)，即為過氧 化氫酶結(jié)晶溶液。
[0045]第三步:利用Index?篩選試劑盒對過氧化氫酶進行結(jié)晶條件篩選。本實驗采用坐 滴法，向每個深孔中加入80μ1的池液，使用自動移液系統(tǒng)將2μ1的結(jié)晶液滴(篩選結(jié)晶劑和 過氧化氫酶溶液1:1混合)滴在實驗組的坐滴孔中，用結(jié)晶膠帶密封結(jié)晶板。以同樣方法把 結(jié)晶液滴加在對照組的坐滴孔中。
[0046] 第四步:將實驗組和對照組的結(jié)晶板都放置在溫控箱中，結(jié)晶溫度為283Κ，結(jié)晶時 間6天，利用自動顯微拍照系統(tǒng)觀察過氧化氫酶晶體的形貌，并統(tǒng)計晶體的條件數(shù)目。
[0047] 第五步:收集并凍存蛋白質(zhì)晶體，利用家用X-射線衍射儀進行晶體的衍射，收集并 分析衍射數(shù)據(jù)。經(jīng)過觀察與統(tǒng)計，得到結(jié)果如下:通過X-射線衍射實驗驗證了上述晶體為過 氧化氫酶晶體，其宏觀上可以產(chǎn)生X-射線衍射現(xiàn)象，衍射的分辨率為2.0 Α。其中實驗組蛋 白質(zhì)的結(jié)晶條件數(shù)目為46,與對照組(結(jié)晶數(shù)為30)相比，以交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、 蛋白質(zhì)酶Κ、奇異果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體作為籽晶的篩選成功率有大幅提高。
[0048] 實施例4:利用交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白 酶原A II晶體籽晶作為籽晶對刀豆球蛋白進行結(jié)晶條件篩選，自然晾干結(jié)晶板，對照組的 結(jié)晶板不做任何處理。
[0049]第一步:吸取ΙμL濃度為20mg/ml的交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異 果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴孔，作為實驗組，對照組的結(jié) 晶板不做任何處理。
[0050] 第二步:將美國Sigma公司生產(chǎn)的L7647刀豆球蛋白，溶于pH為6.50、濃度為0.1M的 Bis-tris緩沖液中，其初始濃度為80mg/ml，即得到刀豆球蛋白結(jié)晶溶液 [0051]第三步：利用Index?篩選試劑盒對刀豆球蛋白進行結(jié)晶條件篩選。本實驗采用坐 滴法，向每個深孔中加入80μ1的池液，使用自動移液系統(tǒng)將2μ1的結(jié)晶液滴(篩選結(jié)晶劑和 刀豆球蛋白溶液1:1混合)滴在實驗組的坐滴孔中，用結(jié)晶膠帶密封結(jié)晶板。以同樣方法把 結(jié)晶液滴加在對照組的坐滴孔中。
[0052]第四步:將實驗組和對照組的結(jié)晶板都放置在溫控箱中，結(jié)晶溫度為288K，結(jié)晶時 間5天，利用自動顯微拍照系統(tǒng)觀察刀豆球蛋白晶體的形貌，并統(tǒng)計晶體的條件數(shù)目。
[0053]第五步:收集并凍存蛋白質(zhì)晶體，利用家用X-射線衍射儀進行晶體的衍射，收集并 分析衍射數(shù)據(jù)。經(jīng)過觀察與統(tǒng)計，得到結(jié)果如下:通過X-射線衍射實驗驗證了上述晶體為刀 豆球蛋白蛋白晶體，其宏觀上可以產(chǎn)生X-射線衍射現(xiàn)象，衍射的分辨率為2.6 A。其中實驗 組刀豆球蛋白的結(jié)晶條件數(shù)目為24,與對照組(結(jié)晶數(shù)為12)相比，以交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧 化氫酶、蛋白質(zhì)酶K、奇異果甜蛋白質(zhì)、糜蛋白酶原A II晶體為籽晶的篩選成功率有大幅提 1? 〇
【主權(quán)項】
1. 一種利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于包括下 述步驟： 第一步，生長蛋白質(zhì)晶體，并對蛋白質(zhì)晶體進行化學(xué)交聯(lián)，將得到的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體溶 于超純水中，濃度均為5-20mg/ml，制得籽晶溶液； 第二步，在結(jié)晶板的每個坐滴孔中滴入〇.5-2μ1的籽晶溶液，自然晾干結(jié)晶板； 第三步，利用Index?篩選試劑盒對蛋白質(zhì)進行結(jié)晶條件篩選，首先制備蛋白質(zhì)溶液;然 后向結(jié)晶板的每個深孔中加入80μ1的池液，將篩選結(jié)晶劑和蛋白質(zhì)溶液按照1:1的質(zhì)量比 混合得到結(jié)晶溶液，將2μ1的結(jié)晶液滴滴入結(jié)晶板的坐滴孔，密封結(jié)晶板，并在277-293Κ的 結(jié)晶溫度下結(jié)晶3-7天； 第四步，觀察蛋白質(zhì)晶體的形貌，統(tǒng)計蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶條件數(shù);收集并衍射蛋白質(zhì)晶 體，獲取衍射數(shù)據(jù)。2. 根據(jù)利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于:所述 的籽晶溶液選用交聯(lián)溶菌酶作為籽晶。3. 根據(jù)利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于:所述 的籽晶溶液選用質(zhì)量比為1:1的交聯(lián)溶菌酶和過氧化氫酶晶體作為籽晶。4. 根據(jù)利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于:所述 的籽晶溶液選用質(zhì)量比為1:1:1:1:1的交聯(lián)溶菌酶晶體、過氧化氫酶、蛋白質(zhì)酶Κ、奇異果甜 蛋白質(zhì)和糜蛋白酶原A II晶體作為軒晶。5. 根據(jù)利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，其特征在于:所述 的化學(xué)交聯(lián)過程中把結(jié)晶母液全部置換成交聯(lián)溶液。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，首先生長蛋白質(zhì)晶體，并對蛋白質(zhì)晶體進行化學(xué)交聯(lián)，將得到的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體溶于超純水中，制得籽晶溶液；然后將籽晶溶液滴入結(jié)晶板的坐滴孔，自然晾干結(jié)晶板；最后利用篩選試劑盒對蛋白質(zhì)進行結(jié)晶條件篩選，利用自動拍照系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)晶體的形貌，并統(tǒng)計蛋白質(zhì)晶體的結(jié)晶條件數(shù)；收集并衍射蛋白質(zhì)晶體，獲取衍射數(shù)據(jù)。本發(fā)明選取交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，可以在空氣中穩(wěn)定存在，利于長期存儲，并且可以重復(fù)利用；本發(fā)明可以有效地提高蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選的成功率。
【IPC分類】C07K1/30
【公開號】CN105566443
【申請?zhí)枴緾N201610004553
【發(fā)明人】尹大川, 閆二開, 張辰艷, 劉雅麗, 周仁斌, 陳達, 劉悅, 李嘉欣
【申請人】西北工業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月6日