養(yǎng)基均需要高壓滅菌。
[0091] 1.2.2纖維素分解菌的初篩
[0092] 分別稱取藏豬胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸盲腸內(nèi)容物lg轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的盛有 100mL無菌水的三角瓶中，在80°C電熱恒溫振蕩水浴鍋中振蕩30min，即成10- 2腸道內(nèi)容物稀 釋液，然后再按10倍稀釋法依次梯度稀釋成10-3-10-6腸道內(nèi)容物稀釋液。篩選培養(yǎng)基制成 固體平板，然后用移液管分別取lOOuL涂于相應(yīng)編號的平板上并做好標號，于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中倒置培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)在來自胃和盲腸的不同梯度的固體培養(yǎng)基中，均有大量的灰白色、 半透明的帶有皺醭的菌落，而在來自小腸段內(nèi)容物的培養(yǎng)基中，此種類型的菌落卻少。然后 我們向每個梯度的培養(yǎng)皿中加入適量0.1 %剛果紅溶液染色lh，棄去染液，加入適量lmol/L NaCl溶液洗滌，1 h后倒出NaCL溶液，發(fā)現(xiàn)這些白色的、半透明的皺醭菌落的周圍均有透明 圈。用游標卡尺測平板上菌落周圍水解圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，發(fā)現(xiàn)該類型菌落的直 徑為0.7cm左右，對羧甲基纖維素的水解圈直徑為2.2cm左右（圖1)。然后用滅菌的接種環(huán)挑 取來自不同腸段的該類型菌落分別在液體的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在CMC平板上反復劃線分 離純化培養(yǎng)4-5代直至得到純化的菌落（圖2)，并將純化培養(yǎng)的菌種加甘油于-80°C保存?zhèn)?用。
[0093] 實驗中，發(fā)明人同時對藏豬胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸每段內(nèi)容物的纖維素分 解進行了分離，發(fā)現(xiàn)在胃和盲腸中最多，在小腸段(十二指腸、空腸、回腸)也發(fā)現(xiàn)有纖維素 分解菌的存在。
[0094] 1.2.3纖維素分解菌發(fā)酵粗酶液的制備及復篩
[0095] 將篩選出的、冷凍保存的各菌株分別在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線進行活化培養(yǎng)， 然后挑單克隆接種到50mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C、220rpm條件下震蕩培養(yǎng)至對數(shù) 期(0D = 1.0)，制成液體菌種。將制備好的液體菌種(0D = 1.0)分別以1 %的接種量接種入 50mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在37°C、220rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，取適量發(fā)酵液于5000rpm、4°C 條件下離心15min，其上清液即為粗酶液，通過測定粗酶液的纖維素酶活對分離的細菌進行 復篩。結(jié)果表明，對初步篩選到的菌株，又根據(jù)其纖維素酶活的測定結(jié)果，選取了纖維素酶 活(0.23U/mL)最高的一株細菌用于后續(xù)的研究，該菌株命名為BY-5纖維素分解菌。
[0096] 實施例2:纖維素分解菌的鑒定
[0097] 2.1形態(tài)學的特征
[0098] BY-5纖維素分解菌在液體LB培養(yǎng)基中于37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)至12h的菌 液進行革蘭氏染色，染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌體呈桿狀，被染成紫色，屬于革蘭氏陽性菌（圖3)。 取培養(yǎng)至24h的菌液用孔雀石綠法進行芽孢染色，結(jié)果顯示，該菌的芽孢被染成綠色，營養(yǎng) 體染成紅色（圖4)。
[0099] 2.2纖維素分解菌的生理生化鑒定
[0100]根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》中的方法對BY-5纖維素分 解菌進行生理生化特性指標測定。根據(jù)表1中的測定結(jié)果表明，試驗菌株的生理生化特性和 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊表》和《伯杰細菌鑒定手冊》解淀粉芽孢桿菌的特性基本一致。因 此，將該試驗中篩選到的試驗菌株初步鑒定為芽胞桿菌屬的解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或其變種。
[0101]表1菌株的生理生化鑒定結(jié)果
[0102]
[0103] 注："+"表示有該特征或可利用該物質(zhì)，"一"表示不具有該特征或不利用該物質(zhì)。
[0104] 2.3纖維素分解菌的的分子生物學鑒定
[0105] 2.3.1纖維素分解菌的16SrRNA基因片段序列測定
[0106] 將冷凍保存的BY-5纖維素分解菌菌種進行活化培養(yǎng)，當培養(yǎng)至對數(shù)期時(OD600 = 1.0-1.5)，離心收集菌體，進行基因組DNA提取。細菌基因組DNA提取方法參照北京天根生化 科技有限公司細菌基因組試劑盒提供的方法進行。然后用細菌通用引物（上游引物27F: 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3 '，下游引物 1492R: 5 ' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '）進行細菌 16S rRNA基因的擴增。PCR 25uL反應(yīng)體系包括:DNA模板0.5uL(保證50-100ng/uL)，上下游引物 各luL，mixTag酶12.5uL，無離子水補足25uUPCR擴增條件為：反應(yīng)條件為：95°C預變性 5min; 94°C30s，55°C30s，72°C50s，35 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 lOmin，4°Cf orever。1 % 的瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果（圖5)，并對PCR擴增產(chǎn)物膠回收，并將回收產(chǎn)物連于pGEM-T載體， 轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，恢復培養(yǎng)lh后涂布于Amp抗性的固體LB培養(yǎng)基平板，37°C過 夜培養(yǎng)。菌落PCR鑒定為陽性菌落后，送北京華大基因生物公司進行測序。將測序結(jié)果在 NCBI上用BLAST軟件在GenBank中進行同源性分析，獲取相近典型菌株的基因序列，利用 Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
[0107] 經(jīng)測序，纖維素分解菌16S rRNA基因序列長度為1455bp，其大小與預期結(jié)果相符 (圖5)，其基因序列（Accession number :KT800418)是：
[0108] GATGGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT AACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAATCG CATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTA ACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGC GTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGG GGAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGT GGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGG TAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA CTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTT CGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAA ACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGA ATCGCTAGTAATCGC GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACG AGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAAGAATAAG
[0109] 2.3.2所分離纖維素分解菌的序列分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建
[0110]將測定的BY-5纖維素分解菌的16S rRNA基因序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有已 測定的原核生物16S rRNA基因進行比對，結(jié)果表明，該纖維素分解菌與NCBI中Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42的遺傳距離最近（圖6)，兩者的16S rRNA基因序列的相 似性達到了 99%，而與已見報道的其他芽孢桿菌屬細菌的遺傳距離雖然較遠，但序列相似 性也均在90%以上。說明分離到的藏豬源纖維素分解菌屬于芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌 的一個種或變種。結(jié)合該細菌的形態(tài)學特征、生理生化特性以及分子鑒定，將本試驗篩選到 的纖維素分解菌株命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BY_5。
[0111] 實施例3Bacillus amyloliquefaciens BY-5生長特性分析
[0112] 將解淀粉芽孢桿菌(1^1〇;[11118 31117101丨9116€3(^6118)1^-5在1^板上劃線，在37°(3條 件下活化培養(yǎng)，挑單克隆接種到5mL液體LB培養(yǎng)基中，在37°C、220rpm條件下震蕩培養(yǎng)到 OD6Q0在1.0~1.5之間，以1 %的接種量接種入60mL新鮮LB培養(yǎng)基，4小時后間隔2h取樣，直至 60h，采用分光光度計法在600nm波長下測定其吸光度，繪制細菌生長曲線。測定結(jié)果表明， 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus &1117101丨9116€3(^6118)13￥-5在接種后8~2811為對數(shù)期，2811以后 開始進入穩(wěn)定期，并且持續(xù)至36h左右，36h后，菌體的繁殖逐漸進入衰退期（圖7)。
[0113] 實施例4纖維素分解菌BY-5纖維素酶活測定
[0114] 4. IBacillus amyloliquefaciens BY-5纖維素酶活測定方法
[0115] 葡萄糖標準曲線的制作及纖維素酶活性的測定方法參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 發(fā)布的纖維素酶活力測定方法(NY/T 912-2004)進行，并根據(jù)實際情況有所改動。
[0116] 4.1.1所需試劑和緩沖液的配置
[0117] (1 )0 · lmol/LpH = 5 · 5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：將65 · OmLO. 2mol/L醋酸鈉溶液和 35.0mL0.2mol/L醋酸溶液混合后加100mL蒸餾水。
[0118] (2) 3,5二硝基水楊酸(DNS)試劑：
[0119] 稱取6.3g的3，5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21. Og NaOH，182g酒石酸鉀鈉，加 500mL水，加熱溶解后再加入5.0g重蒸酚和5.0g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000mL。
[0120] (3)葡萄糖標準溶液（10mg/mL):稱取l.OOOg葡萄糖(AR)(105°C干燥至恒重）用蒸 餾水溶解后定容至l〇〇mL。
[0121] (4)羧甲基纖維素鈉溶液：稱2.0g CMC-Na溶于200mL蒸餾水中，加醋酸緩沖溶液 100mL〇
[0122] 4.1.2葡萄精標準曲線的制作
[0123] 標準空白樣:吸取pH = 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液4. OmL，加入DNS試劑5 . OmL，沸 水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25. OmL，制成標準空白樣。
[0124] 分別吸取1 · Omg/mL葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分別用緩沖液 定容至1 OmL，配制成濃度為0.1 -0.7mg/mL的葡萄糖標準溶液。然后按照表2進行：
[0125] 表2標準溶液配制比例
[0126]
[0127]
[0128] 將上述各試管混合液，輕柔地搖動混勻，沸水浴加熱5min，流水冷卻后用蒸餾水定 容至25mL，搖勻，在540nm吸收峰處測吸光度，以葡萄糖含量為縱坐標，以O(shè)D 54〇為橫坐標作 圖，得葡萄糖濃度和〇D540的關(guān)系曲線（圖8)。
[0129] 4.1.3纖維素酶活力的測定
[0130] Ab : 2mL經(jīng)適當稀釋的酶液加入5mL DNS，混勻，再加入2mL底物，混勻，沸水煮沸 5min，定容至25mL，以標準空白樣(見4.1.2)為空白，在540nm波長條件下測定吸光值A(chǔ)b。
[0131] AE:2mL經(jīng)適當稀釋的酶液加入2mL 1%CMC，混勻，40°C準確反應(yīng)30min，再加入5mL DNS，混勻，沸水煮沸5min，，定容至25mL，以標準空白樣(見4.1.2)為空白，在540nm波長條件 下測定吸光值A(chǔ)e。
[0132] 酶活單位定義：在pH = 5.5，40°C，反應(yīng)30min條件下，每分鐘由底物羧甲基纖維素 鈉降解產(chǎn)生Ιμπιο?還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，用U/mL表示。
[0133] 4