驗證正確的菌株42 °C熱激后劃線LB平板，挑取單菌落驗證其對氨芐 青霉素及卡那霉素的敏感性，選取對兩種抗生素均敏感的菌株命名為和 C · sakazaki iBAA894AESA-03574并保藏。
[0034] 實施例2BAA894 Δ ESA-03574對ESA-02008基因轉(zhuǎn)錄的影響。
[0035] 總RNA提取：利用Simply P Total RNA Extrection Kit(購自Bioflux公司）分別 提取BAA894和BAA894 Δ ESA-03574在pH 5.0條件下的總RNA。以去除DNA污染的RNA為模板， 利用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(購自Thermo Scientific)合成 cDNA。以16S rRNA作為內(nèi)參，每組三個平行，檢測ESA-02008在低pH下的轉(zhuǎn)錄水平。
[0036] 已有報道顯不E SA-0 3 5 7 4 即 pmr A，在E.coli 和 S.typhimurium 中，pmr A 位于 pmr CAB 操縱子中，調(diào)控pmrC的表達。然而，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)C. sakazakii BAA894中ESA_02008(即pmrC)， 在低pH條件下的轉(zhuǎn)錄水平依舊很高，說明ESA-03574的缺失，并不影響ESA-02008的表達，也 就是說該基因不在調(diào)控ESA-02008。
[0037] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)C. sakazakii BAA894中ESA-02008不屬于pmrCAB操縱子中，并不受 ESA-03574 的調(diào)控。
[0038] 實施例3突變菌株C.sakazakiiΔESA-03574的類脂A的結(jié)構(gòu)進行ESI/MS分析。
[0039]類脂A的提取方法采用氯仿/甲醇/H20溶液混合相萃取法。將過夜培養(yǎng)的菌液按初 始0D6QQ = 0.02轉(zhuǎn)接到200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體對數(shù)期后期時，4000rpm離心 30min收集菌體，ddH2〇洗滌菌體一次后用B1 igh-Dyer-相體系（氯仿/甲醇/水溶液，1: 2: 0.8，v/v/v) 76mL懸浮菌體，磁力攪拌lh，2000rpm離心30min分相，使用一相體系洗滌細(xì)胞碎 片2-3次;加入27mL 12.5mM的醋酸鈉(PH4.5)溶液，超聲震蕩2min，100°C水浴30min裂解糖 鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成B1 igh-Dyer二相體系（氯仿/甲醇/水，2 : 2: 1.8，v/v/v)，2000rpm離心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。加入氯仿/甲醇溶液(4: 1，v/v)將1 ipidA洗出。類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-T0F Mass Spectrometer質(zhì)譜儀上進行質(zhì)譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小 于m/z 2500。
[0040]質(zhì)譜結(jié)果分析顯示，ESA-03574基因缺失之后，ESA-02008修飾的峰值1868仍然存 在，也就是說該基因的缺失不影響ESA-02008的表達。ESA-02008不再受ESA-03574的調(diào)控。 [0041 ]實施例4突變株細(xì)菌外膜滲透性
[0042] NPN是一種非極性熒光探針分子，它可以在疏水環(huán)境中表現(xiàn)出熒光吸收特性，因此 這種物質(zhì)可以作為研究細(xì)菌外膜滲透性的探針分子。
[0043]將過夜培養(yǎng)的菌液按照初始0D600 = 0.02轉(zhuǎn)接到50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm/min培養(yǎng)至0D600= 1.0，離心收集菌體，用roS緩沖液洗滌一次并重懸。將1.92ml重 懸菌液和80μ1 lmmol/1的NPN溶液加入石英比色皿中，混合之后測定熒光吸收值，這一數(shù)值 的大小代表細(xì)胞外膜滲透性的大小。熒光分光光度計激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為420nm， 縫寬5mm。結(jié)果如圖3所示，可知:該基因缺失之后，細(xì)胞膜的通透性變強，對一些抗生素的抵 抗能力會減弱，更容易被殺死。
[0044]實施例5突變株對陽離子抗性肽的抗性
[0045] 采用微量肉湯稀釋法分別測定C. sakazakii BAA894菌株對陽離子抗性肽的MIC 值。
[0046]粘菌素是由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。其環(huán)形多肽部分的氨基與細(xì) 菌外膜脂多糖的2價陽離子結(jié)合點產(chǎn)生靜電相互作用，使外膜的完整性破壞，導(dǎo)致胞漿內(nèi)的 磷酸、核苷等小分子外溢，引起細(xì)胞功能障礙直至死亡。
[0047] 抗生素用LB液體培養(yǎng)基倍比稀釋，使?jié)舛确謩e為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、 0·78、0·39、0· 19yg/mL，而 colistin 濃度為 500、250、125、62·5、31·25、15·625、7·8125、 3.90625、1.8、0.9、0.45yg/mL加入96孔板中，留一排新型LB培養(yǎng)基作生長對照；另將等體積 0D6QQ = 0.01的稀釋菌液加入96孔板中，蓋上蓋子，37°C靜置培養(yǎng)12h，用酶標(biāo)儀測定菌液 OD6〇Q。將OD600小于0.15的點對應(yīng)的抗生素濃度定義為菌株對多粘菌素的MIC值。突變株對多 粘菌素的抗性均增強。結(jié)果如表1所示。由表1可知，該基因缺失之后對陽離子抗菌肽的抗性 減弱，但是pH不同，抗性的強弱也不同。pH 5.0條件下野生型的抗性最強，pH 5.0條件下 BAA894 Δ ESA-03574抗性有所降低但比pH 7.0條件下野生型高，說明ESA-03574在低pH條件 下對陽離子抗菌肽的抗性起作用。
[0048] 表1 BAA894野生型及突變株對多粘菌素 B和colistin的MIC值
[0049]
[0050]實施例6C. sakazakii突變菌株對TLR4信號通路激活的能力 [0051 ] HEK-Blue hTLR4細(xì)胞因轉(zhuǎn)染表達了人類TLR4及NF-kB誘導(dǎo)分泌的SEAP報告基因， 能夠特異性地識別培養(yǎng)體系中活細(xì)菌體表明的LPS而分泌藍色的SEAP激酶，實時監(jiān)測LPS誘 導(dǎo)的TLR4免疫通路的強弱，通過SEAP顯色的深淺指示出菌體對TLR4的刺激能力和對細(xì)胞的 毒性。吸光值越大，對細(xì)胞毒性越大。
[0052]基因工程菌成功構(gòu)建后，菌體表明LPS結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大的變化，通過用活菌體直 接刺激HEK-Blue hTLR4細(xì)胞，能最直觀地反映出菌體及其合成的LPS的細(xì)胞毒性變化趨勢。 [0053] 圖4為野生型BAA894(對照組)與突變株(實驗組）的顯色結(jié)果。如圖，對照組和實驗 組各菌株都能有效激起TLR4信號通路;在菌濃為在活菌濃度為104~106CFU/mL范圍內(nèi)，各菌 株的HEK-Blue的顯色反應(yīng)線性最明顯。在菌濃為105CFU/mL時，對TLR4通路的刺激能力 BAA894>BAA894AESA-03574,實驗組菌株的TLR4的刺激能力比其對照組的出發(fā)菌略低約 10%。由此可見lipidA部分的精細(xì)結(jié)構(gòu)是決定菌體對TLR4的刺激能力和對細(xì)胞的毒性的主 要因素。
[0054] 由對TLR4通路的激活能力，ESA-03574基因?qū)τ陂_發(fā)減毒的疫苗佐劑有作用。
[0055] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種Cronobacter sakazakii的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌缺失了 ESA-03574基因片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ESA-03574基因片段的核苷酸 序列是SEQ ID N0:1的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為無抗性 C.sakazakii BAA894AESA_03574,以Cronobacter sakazakii BAA894為出發(fā)菌、缺失了核 苷酸序列為SEQ ID NO: 1的ESA-03574基因片段。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的構(gòu)建方法如下： 將人工構(gòu)建的ESA-03574敲除片段電轉(zhuǎn)化入含pKD46質(zhì)粒的C. sakazakii BAA894,獲得突變 株C. sakazakiiBAA894 Δ ESA-03574-loxPkan，再化轉(zhuǎn)入pKD-Cre質(zhì)粒，通過位點特異性重組 敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre質(zhì)粒后獲得無抗性lipid A的基因結(jié)構(gòu)突變的基因工 程菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸 序列如SEQ ID NO:2所示。6. 一種降低Cronobacter sakazakii對陽離子抗菌肽抗性和/或降低Cronobacter sakazaki i對HEK4細(xì)胞刺激作用的方法，其特征在于，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii 菌的ESA-03574基因片段。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述Cronobacter sakazakii菌株為 BAA894;所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1的序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，敲除了 ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii菌在低pH條件下作用。9. 權(quán)利要求1-5任一所述基因工程菌在陽離子抗性肽及在疫苗佐劑上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)減毒類脂A的Cronobacter？sakazakii突變株及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的Cronobacter？sakazakii突變株的ESA-03574基因片段進行敲除，使Cronobacter？sakazakii菌株對陽離子抗菌肽抗性顯著降低、更容易被抗菌肽殺死，本發(fā)明的Cronobacter？sakazakii突變株細(xì)胞激活TLR4免疫通路的能力減弱，對細(xì)胞毒性減弱，有利于疫苗佐劑的開發(fā)。
【IPC分類】A61P37/04, C12R1/01, C12N15/74, C12N1/21, A61K39/39
【公開號】CN105567620
【申請?zhí)枴緾N201610065729
【發(fā)明人】李顏顏, 王小元, 劉璐, 王琳
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月29日