1,2,4-丁三醇相關(guān)蛋白在生物法制備1,2,4-丁三醇中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中1，2, 4-丁三醇相關(guān)蛋白在生物法制備1，2, 4-丁三醇 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 從自然資源中發(fā)掘新酶或人工設(shè)計(jì)新酶是合成生物技術(shù)的基礎(chǔ)，自然界中的生物 多樣性和豐富的基因資源為發(fā)掘具有心功能的酶提供了廣闊的來源，通過挖掘新酶已經(jīng)使 人類能夠合成很多自然界中不存在的有用化學(xué)品。
[0003] 1，2, 4-丁三醇是一種在軍工和民用上都具有重要用途的化學(xué)品。它是一種手性多 羥基醇，作為重要的有機(jī)合成中間體，可用于制備生物活性劑、醫(yī)藥用緩釋劑、卷煙添加劑、 抗菌劑、彩色顯影劑等。其硝化產(chǎn)物1，2, 4-丁三醇三硝酸酯，可作為飛機(jī)、火箭、導(dǎo)彈等軍 事武器的推進(jìn)劑，較硝化甘油具有沖擊敏感性低、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，1，2, 4- 丁三醇 的工業(yè)化生產(chǎn)主要依靠化學(xué)合成法，缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多，產(chǎn)物產(chǎn)率低，對(duì)環(huán)境有危害等，由此 也限制了 1，2, 4- 丁三醇及1，2, 4- 丁三醇三硝酸酯的商業(yè)前景。
[0004] 自然界不存在1，2, 4-丁三醇的天然生物合成途徑，所以生物法生產(chǎn)1，2, 4-丁三 醇的研究進(jìn)展比較緩慢。2003年，Wei Niu等使用雙微生物工藝，以D-木糖和L-阿拉伯糖為 碳源，建立了 1，2, 4- 丁三醇的生物合成途徑（Niu, W.，Molefe, Μ· N.，F(xiàn)rost, J. W. Microbial synthesis of the energetic material precursor 1, 2, 4-butanetriol. Journal of the American Chemical Society. 2003, 125 (43): 12998-12999·)。隨后進(jìn)一步改良該方法，建 立了在大腸桿菌利用D-木糖合成1，2, 4- 丁三醇的生物合成系統(tǒng)（J *W ·佛羅斯特，W ·牛， D-1，2, 4- 丁三醇的微生物合成，中國專利【申請(qǐng)?zhí)枴?00780032753. 9,申請(qǐng)日：2007年7月19 日）。這些研究中，從木糖轉(zhuǎn)化為1，2, 4-丁三醇的生物反應(yīng)途徑主要包括脫氫、脫水、脫羧、 加氫4步反應(yīng)，其中，第二步（脫水）和第四步（加氫）反應(yīng)所需的酶在大腸桿菌中天然 存在，而第一步和第三步反應(yīng)的酶需外源導(dǎo)入。前人研究中催化第一步脫氫反應(yīng)的酶為木 糖脫氫酶（XDH)，來源于新月柄桿菌（Caulobacter crescentus);催化第三步反應(yīng)的酶為 2-酮酸脫羧酶，是來自惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)的苯甲酰甲酸脫羧酶（MDLC)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高生物法生產(chǎn)1，2, 4-丁三醇的產(chǎn)量和得 率。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供1，2, 4-丁三醇相關(guān)蛋白或其編碼基因在 制備1，2, 4-丁三醇中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的1，2, 4-丁三醇相關(guān)蛋白在制備1，2, 4-丁三醇中的應(yīng)用中，所述 1，2,4-丁三醇相關(guān)蛋白的名稱為851^，所述851^，是如下81)或82)的蛋白質(zhì)：
[0008] B1)氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)；
[0009] B2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由548個(gè)氨基酸殘基組成。
[0011] 上述B2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述B2)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述BSRP的基因?yàn)橄率鯞ll)-B13)中的任一種DNA分子：
[0013] B11)編碼序列是SEQ ID No. 2的第71-1717位核苷酸所示的cDNA分子或基因組 DNA ；
[0014] B12)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的DNA分子雜交且編碼所述BSRP的cDNA分子或 基因組DNA ;
[0015] 813)與811)或價(jià)2)限定的0嫩分子具有75%以上的同一性且編碼所述831^的 cDNA分子或基因組DNA。
[0016] 其中，SEQ ID No. 2由1726個(gè)核苷酸組成，SEQ ID No. 2的第71-1717位核苷酸編 碼SEQ ID No. 1所示的氨基酸。
[0017] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對(duì)本發(fā)明的編碼所述BSRP的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā) 明分離得到的所述BSRP的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述BSRP， 均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0018] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"75%以上的同一性" 包括與本發(fā)明的編碼BSRP的核苷酸序列具有75 %或更高，或85 %或更高，或90 %或更高， 或95 %或更高，或97 %或更高，或99 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗 膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 15min〇
[0020] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建用于生產(chǎn)1，2, 4- 丁三醇的重組 細(xì)胞的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建用于生產(chǎn)1，2, 4-丁三醇的重組細(xì)胞的方法，包括對(duì)受體細(xì) 胞進(jìn)行A3)、A5)、A6)和A7)的改造得到重組細(xì)胞的步驟：
[0022] A3)將所述受體細(xì)胞的木糖異構(gòu)酶基因敲除；
[0023] A5)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入木糖脫氫酶基因；
[0024] A6)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入醇脫氫酶基因；
[0025] A7)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入1，2, 4- 丁三醇相關(guān)蛋白基因；
[0026] 所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0027] 上述方法中，所述方法還包括對(duì)所述受體細(xì)胞進(jìn)行Al)、A2)和A4)中任一種、任兩 種或三種的改造得到重組細(xì)胞的步驟：
[0028] A1)將所述受體細(xì)胞的2-酮酸脫氫酶基因敲除；
[0029] A2)將所述受體細(xì)胞的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因敲除；
[0030] A4)將所述受體細(xì)胞的木酮糖激酶基因敲除；
[0031] 上述方法中，所述微生物細(xì)胞可來自埃希氏菌屬（Escherichia)，如大腸桿菌，具 體可為BL21 (DE3)、大腸桿菌BW25113或大腸桿菌BW25113的突變體等。
[0032] 由于在所述大腸桿菌中存在如圖8所示的代謝途徑，所以，上述方法中所述重組 細(xì)胞可為對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞， 所述重組細(xì)胞還可為對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行所述所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、 所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì)胞進(jìn)行所述A1)、所述A3)、所述 A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì)胞進(jìn)行所述A2)、所述A3)、所 述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì)胞進(jìn)行所述所述A3)、所 述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì)胞進(jìn)行所述所述 A1)、所述A2)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì) 胞進(jìn)行所述所述A1)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重組 細(xì)胞，或?qū)κ荏w細(xì)胞進(jìn)行所述所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7) 的改造得到的重組細(xì)胞。
[0033] 上述方法中，所述2-酮酸脫氫酶基因?yàn)?-酮酸脫氫酶基因 ycdW和yiaE ;所述 3_脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因?yàn)?-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因 yagE和 yjhH ;所述木糖異構(gòu)酶基因?yàn)槟咎钱悩?gòu)酶基因 xylA ;所述木酮糖激酶基因?yàn)槟就羌っ富?因 xylB ;所述醇脫氫酶基因?yàn)榇济摎涿富?adhP ;所述木糖脫氫酶基因?yàn)槟咎敲摎涿富?xdh〇
[0034] 上述方法中，所述2-酮酸脫氫酶基因 yiaE編碼下述HI)或H2)的蛋白質(zhì)：
[0035] H1)氨基酸序列為SEQ ID No. 3的蛋白質(zhì)；
[0036] H2)在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有2-酮酸脫氫酶功能的由H1)衍生的蛋白質(zhì)；
[0037] 所述2-酮酸脫氫酶基因 ycdW編碼下述II)或12)的蛋白質(zhì)：
[0038] II)氨基酸序列為SEQ ID No. 5的蛋白質(zhì)；
[0039] 12)在SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有2-酮酸脫氫酶功能的由II)衍生的蛋白質(zhì)；
[0040] 所述3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因 yagE編碼下述J1)或J2)的蛋白 質(zhì)：
[0041] J1)氨基酸序列為SEQ ID No. 7的蛋白質(zhì)；
[0042] J2)在SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶功能的由J1)衍生的蛋白 質(zhì)；
[0043] 所述3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH編碼下述K1)或K2)的蛋白 質(zhì)：
[0044] K1)氨基酸序列為SEQ ID No. 9的蛋白質(zhì)；
[0045] K2)在SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶功能的由K1)衍生的蛋白 質(zhì)；
[0046] 所述木糖脫氫酶基因 xdh編碼下述L1)或L2)的蛋白質(zhì)：
[0047] L1)氨基酸序列為SEQ ID No. 11的蛋白質(zhì)；
[0048] L2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有木糖脫氫酶功能的由L1)衍生的蛋白質(zhì)；
[0049] 所述醇脫氫酶基因 adhP編碼下述Ml)或M2)的蛋白質(zhì)：
[0050] Ml)氨基酸序列為SEQ ID No. 13的蛋白質(zhì)；
[0051] M2)在SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有醇脫氫酶功能的由Ml)衍生的蛋白質(zhì)；
[0052] 所述木糖異構(gòu)酶基因 xylA編碼下述01)或02)的蛋白質(zhì)：
[0053] 01)氨基酸序列為SEQ ID No. 17的蛋白質(zhì)；
[0054] 02)在SEQ ID No. 17所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有木糖異構(gòu)酶功能的由01)衍生的蛋白質(zhì)；
[0055] 所述木酮糖激酶基因 xylB編碼下述P1)或P2)的蛋白質(zhì)：
[0056] P1)氨基酸序列為SEQ ID No. 19的蛋白質(zhì)；
[0057] P2)在SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有木酮糖激酶功能的由P1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0058] 上述方法中，所述2-酮酸脫氫酶基