夜，使菌體基因組上的卡那霉素抗性消除；挑選單克隆菌株，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn) 證，引物對(duì)為yiaE up和yiaE down (yiaE up和yiaE down的序列見(jiàn)表1),目的片段大小 262bp。其中，yiaE up和yiaE down引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌BW25113的yiaE基因的 上游83-61bp和下游46-70bp附近區(qū)域。將擴(kuò)增出大小為262bp的陽(yáng)性克隆分別在無(wú)抗性 LB平板和含有終濃度為50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上劃線(xiàn)，只在無(wú)抗性的LB平板上生長(zhǎng) 的菌株為卡那霉素抗性基因缺失的菌株，將該菌株于無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小時(shí)。pCP20 為溫敏型質(zhì)粒，在無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小時(shí)可將質(zhì)粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20 質(zhì)粒均消除的菌株，將其命名為BW25113 Λ yiaE。
[0157] 2、BW25113AyiaEAycdW 的構(gòu)建：
[0158] 將pKD46質(zhì)粒通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至上述步驟1得到的BW25113 Λ yiaE中，得 到含有質(zhì)粒PKD46的重組大腸桿菌BW25113 Λ yiaE/pKD46。重組大腸桿菌BW25113 Λ yiaE/ PKD46在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá)λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能 力。
[0159] 利用 5' 端含 ycdW 同源臂的擴(kuò)增引物對(duì) ycdW(Kan)Pl 和 ycdW(Kan)P2(ycdW(Kan) P1和ycdW (Kan) P2的序列見(jiàn)表1)，以質(zhì)粒pKD4為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物為 兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Dpnl酶處理，并用 eye 1印ure純化試劑盒（Omega)回收，將回收得到的兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因 片段電轉(zhuǎn)至上述BW25113AyiaE/pKD46中，在含有終濃度50μ g/ml卡那霉素的LB平板上 篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，引物對(duì)為ycdW up和步驟1中所述kan(ycdW up和kan的序列見(jiàn)表1),目的片段大小為1095bp，其中，ycdW up和kan引物結(jié)合位置分 別是大腸桿菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和kan基因的566-582bp附近區(qū)域。 PCR擴(kuò)增出大小為1095bp的陽(yáng)性克隆為BW25113 Λ yiaE的突變體，測(cè)序分析結(jié)果表明該突 變體的基因組上沒(méi)有ycdW基因。該突變體是將大腸桿菌BW25113的2-酮酸脫氫酶基因 (ycdW)替換為兩端帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因（約1439bp)從而將BW25113AyiaE 的ycdW基因敲除，保持所述BW25113 △ yiaE的其它基因不變得到的突變體，將該突變體命 名為 BW25113AyiaEAycdWkan。
[0160] 利用表達(dá)Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20消除上述BW25113 Λ yiaE Λ ycdWkan的卡那霉 素抗性，具體步驟如下：采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入上述BW25113 Λ yiaE Λ ycdWkan 中，在含有終濃度25 μ g/ml氯霉素的LB平板上于30°C下培養(yǎng)過(guò)夜，使菌體基因組上的 卡那霉素抗性消除；挑選單克隆菌株，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，引物對(duì)為ycdW up和ycdW down (ycdW up和ycdW down的序列見(jiàn)表1),目的片段大小257bp。其中，ycdW up和ycdW down引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和下游43-67bp附 近區(qū)域。將擴(kuò)增出大小為257bp的陽(yáng)性克隆分別在無(wú)抗性L(fǎng)B平板和含有終濃度為50 μ g/ ml卡那霉素的LB平板上劃線(xiàn)，只在無(wú)抗性的LB平板上生長(zhǎng)的菌株為卡那霉素抗性基因缺 失的菌株，將該菌株于無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小時(shí)。pCP20為溫敏型質(zhì)粒，在無(wú)抗性L(fǎng)B中 42°C培養(yǎng)6小時(shí)可將質(zhì)粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20質(zhì)粒均消除的菌株，將其命名為 BW25113AyiaEAycdW。
[0161] 3、BW25113 Δ yiaE Δ ycdWA yagE 的構(gòu)建：
[0162] 將pKD46質(zhì)粒通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至上述步驟2得到的BW25113 Δ yiaE Δ ycdW 中，得到含有質(zhì)粒PKD46的重組大腸桿菌BW25113AyiaEAycdW/pKD46。重組大腸桿菌 BW25113AyiaEAycdW/pKD46在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá)λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白，宿主菌就 具有了同源重組的能力。
[0163] 利用 5' 端含 yagE 同源臂的擴(kuò)增引物對(duì) yagE(Kan)Pl 和 yagE(Kan)P2(yagE(Kan) P1和yagE(Kan)P2的序列見(jiàn)表1，以質(zhì)粒pKD4為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物為 兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Dpnl酶處理，并 用cyclepure純化試劑盒（Omega)回收，將回收得到的兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗 性基因片段電轉(zhuǎn)至上述BW25113ΛyiaEΛy CdW/pKD46中，在含有終濃度50μg/ml卡那霉 素的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，引物對(duì)為yagE up和步驟 1中所述kan (yagE up和kan的序列見(jiàn)表1),目的片段大小為1591bp，其中，yagE up和 kan引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌BW25113的yagE基因的上游598-579bp和kan基因 的566-582bp附近區(qū)域。PCR擴(kuò)增出大小為1591bp的陽(yáng)性克隆為BW25113AyiaEAycdW 的突變體，測(cè)序分析結(jié)果表明該突變體的基因組上沒(méi)有y a gE基因。該突變體是將 BW25113 Λ yiaE Λ ycdW的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因（yagE)替換為兩端帶 有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因（約1439bp)從而將BW25113 Λ yiaE Λ ycdW的yagE基因 敲除，保持所述BW25113 △ yiaE Λ ycdW的其它基因不變得到的突變體，將該突變體命名為 BW25113 Δ yiaE Δ ycdWA yagEkan。
[0164] 利用表達(dá)Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20消除上述BW25113AyiaEAycdWAyagEkan 的卡那霉素抗性，具體步驟如下：采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入上述 BW25113AyiaEAycdWAyagEkan中，在含有終濃度25μ g/ml氯霉素的LB平板上于30°C 下培養(yǎng)過(guò)夜，使菌體基因組上的卡那霉素抗性消除；挑選單克隆菌株，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn) 證，引物對(duì)為yagE up和yagE down (yagE up和yagE down的序列見(jiàn)表1),目的片段大小 1200bp。其中，yagE up和yagE down引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌BW25113的yagE基因 的上游598-579bp和下游493-512bp附近區(qū)域。將擴(kuò)增出大小為1200bp的陽(yáng)性克隆分別 在無(wú)抗性L(fǎng)B平板和含有終濃度為50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上劃線(xiàn)，只在無(wú)抗性的LB 平板上生長(zhǎng)的菌株為卡那霉素抗性基因缺失的菌株，將該菌株于無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小 時(shí)。PCP20為溫敏型質(zhì)粒，在無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小時(shí)可將質(zhì)粒消除，得到卡那霉素抗 性和PCP20質(zhì)粒均消除的菌株，將其命名為BW25113AyiaEAycdWAyagE。4、BW-004的構(gòu) 建：
[0165] 將pKD46質(zhì)粒通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至上述步驟3得到的 BW25113AyiaEAycdWAyagE中，得到含有質(zhì)粒pKD46的重組大腸桿菌 BW25113 Λ yiaE Λ ycdW Λ yagE/pKD46。重組大腸桿菌 BW25113 Λ yiaE Λ ycdW Λ yagE/pKD46 在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá)λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。
[0166] 利用 5' 端含 yjhH 同源臂的擴(kuò)增引物對(duì) yjhH(kan)Pl 和 yjhH(kan)P2(yjhH(kan) P1和y jhH (kan) P2的序列見(jiàn)表1)，以質(zhì)粒pKD4為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物為 兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Dpnl酶處理，并用 eye 1印ure純化試劑盒（Omega)回收，將回收得到的兩側(cè)含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因 片段電轉(zhuǎn)至上述BW25113 Λ yiaE Λ ycdW Λ yagE/pKD46中，在含有終濃度50 μ g/ml卡那霉素 的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，引物對(duì)為yjhH up和步驟1中所 述kan(yjhHup和kan的序列見(jiàn)表1),目的片段大小為1593bp，其中，yjhH up和kan引物結(jié) 合位置分別是大腸桿菌BW25113的y jhH基因的上游579-559bp和kan基因的566-582bp附 近區(qū)域。PCR擴(kuò)增出大小為1593bp的陽(yáng)性克隆為BW25113的突變體，測(cè)序分析結(jié)果表明該突 變體的基因組上沒(méi)有yjhH基因。該突變體是將大腸桿菌BW25113的3-脫氧-D-甘油-戊 酮糖酸醛縮酶基因（yjhH)替換為兩端帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因（約1439bp)從而 將 BW25113 Δ yiaE Δ ycdWA yagE 的 yjhH 基因敲除，保持所述 BW25113 Δ yiaE Δ ycdWA yagE 的其它基因不變得到的突變體，將該突變體命名為BW25113 Λ yiaE Λ ycdW Λ yagEkan。
[0167] 利用表達(dá)Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20消除上述BW25113AyiaEAycdWAyagEkan 的卡那霉素抗性，具體步驟如下：采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)入上述 BW25113AyiaEAycdWAyagEkan中，在含有終濃度25μ g/ml氯霉素的LB平板上于30°C 下培養(yǎng)過(guò)夜，使菌體基因組上的卡那霉素抗性消除；挑選單克隆菌株，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn) 證，引物對(duì)為yjhH up和yjhH down (yjhH up和yjhH down的序列見(jiàn)表1),目的片段大小 1179bp。其中，yjhH up和yjhH down引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌BW25113的yjhH基因 的上游579-559bp和下游468-489bp附近區(qū)域。將擴(kuò)增出大小為1179bp的陽(yáng)性克隆分別 在無(wú)抗性L(fǎng)B平板和含有終濃度為50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上劃線(xiàn)，只在無(wú)抗性的LB 平板上生長(zhǎng)的菌株為卡那霉素抗性基因缺失的菌株，將該菌株于無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小 時(shí)。PCP20為溫敏型質(zhì)粒，在無(wú)抗性L(fǎng)B中42°C培養(yǎng)6小時(shí)可將質(zhì)粒消除，得到卡那霉素抗 性和PCP20質(zhì)粒均消除的菌株，將其命名為BW25113 Λ yiaE Λ ycdW Λ yagE Λ yjhH。
[0168] 對(duì)上述BW25113ΛyiaEΛyCdWΛyagEΛyjhH進(jìn)行菌落PCR，引物對(duì)為以下四種 ： yjhH up 和 yjhH down> ycdff up 和 ycdW down、yagE up 和 yagE down、yiaE up 和 yiaE (1〇前，其中，能同時(shí)擴(kuò)增出大小分別為117%?、257&?、1591&?和262&?四種條帶的菌株為成 功將yjhH、ycdW、yagE和yiaE四個(gè)基因敲除的菌株，將其命名為BW-004。
[0169] 5、BW_010 的構(gòu)建：
[0170] 1)合成 SEQ ID No. 21 所示的 DNA片段"xdh-TlT2-adhP-miniPtac"，SEQ ID No. 21 的第1-747位核苷酸與序列表中SEQ ID No. 12位核苷酸一致，編碼SEQ ID No. 11所示的 氨基酸序列，SEQ ID No. 21的第1315-2325位核苷酸與SEQ ID No. 14的第1-1011位核苷 酸反向互補(bǔ)，SEQ ID No. 21的第2349-2377位核苷酸與tac啟動(dòng)子的核苷酸序列反向互補(bǔ)， SEQ ID No. 21的第896-924位核苷酸與rrnB T2終止子的核苷酸序列反向互補(bǔ)，SEQ ID No. 21的第1055-1009位核苷酸與rrnB T1終止子的核苷酸序列反