一種高抗氧化性蛋白肽及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)加工及綜合利用領(lǐng)域，特別涉及一種高抗氧化性蛋白肽及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]研究發(fā)現(xiàn)活性肽類(lèi)在人體內(nèi)消化吸收機(jī)制比游離氨基酸更好，這些氨基酸無(wú)法比擬的特點(diǎn)使得生物活性肽成為研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。某些海洋生物含有豐富的蛋白質(zhì)，是提取生物活性肽的理想原材料。海洋生物活性肽來(lái)源廣泛，生理功能繁多，安全性高，且根據(jù)目前的研究報(bào)導(dǎo)，海洋生物來(lái)源的活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、降血脂、抗菌、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)骨強(qiáng)度等。制備活性肽的來(lái)源包括魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、蝦蟹等甲殼類(lèi)，還有海藻、?？?、海鞘、海綿、海星等，利用不同的原材料以及不同制備條件，可以獲得不同生理活性與效價(jià)的肽類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái)，制備海洋活性肽的原料資源不斷擴(kuò)展，工藝技術(shù)不斷改善，其功能性和安全性也不斷完善，但總體而言，這些生物活性肽的研究及生產(chǎn)利用滯后于陸地生物活性肽，研究利用也主要以魚(yú)類(lèi)功能性肽為主，利用軟體動(dòng)物和甲殼動(dòng)物制備活性肽則較少。
[0003]抗氧化肽是基于清除自由基或螯合金屬離子的能力而具有抗氧化活性。有研究發(fā)現(xiàn)從水產(chǎn)品中提取得到的抗氧化肽可以提高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷甘胱肽過(guò)氧化物酶的活性，對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷有保護(hù)作用，被認(rèn)為可抑制癌變以及帕金森氏病和阿茲海默癥等神經(jīng)退行性病變。
[0004]在蟹類(lèi)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中還鮮少看到有抗氧化肽的研究，酶解蟹肉蛋白制備抗氧化肽可以成為制備活性肽的新來(lái)源，尤其是從蟹加工下腳料中殘留蟹肉制備抗氧化肽，這是變廢為寶、綜合利用海洋蛋白資源的一個(gè)有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種高抗氧化性蛋白肽的制備方法，該方法綜合利用水產(chǎn)低值蛋白資源，以我國(guó)重要海產(chǎn)蟹類(lèi)加工下腳料為原料，采用高效水解蛋白酶，定點(diǎn)水解，并采用超濾技術(shù)，有針對(duì)性地分離高抗氧化性肽段，以獲取具有高抗氧化活性的多肽物質(zhì)。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的高抗氧化性蛋白肽。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述高抗氧化性蛋白肽的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn):
[0009]—種高抗氧化性蛋白肽的制備方法，包含如下步驟:
[0010](I)預(yù)處理
[0011]將破碎過(guò)篩后的蟹加工下腳料與異丙醇混合均勻后回流加熱脫脂，清洗并干燥脫脂后的蟹加工下腳料，得到蟹粉；
[0012](2)蛋白酶水解處理
[0013]取步驟(I)制得的蟹粉與水混勻后加熱至50?62°C，調(diào)整反應(yīng)體系pH值為8.2?9.0，然后加入堿性蛋白酶，50?62°C酶解1.5?2.5h;酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系加熱到85?100°C，保溫10?15min，使堿性蛋白酶失活;將反應(yīng)體系冷卻到45?60°C，并調(diào)整反應(yīng)體系pH值為6.5?7.5，然后加入中性蛋白酶，45?60°C酶解1.5?2.5h ；酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系加熱到85?1000C，保溫10?15min，使酶失活;然后離心分離，得到上清液；
[0014](3)超濾
[0015]將步驟(2)制得的上清液加熱到40?50°C，然后超濾分離，分離得到分子量小于1kDa的多肽溶液；
[0016](4)凝膠色譜過(guò)濾
[0017]將步驟(3)超濾得到的多肽溶液過(guò)凝膠色譜SephadexG-25M柱，收集得到分子量為1000?5000的多肽分子的溶液；
[0018](5)濃縮及干燥
[0019]將步驟(4)收集的溶液經(jīng)濃縮，然后干燥，得到干態(tài)多肽物質(zhì)，即為高抗氧化性蛋白妝；
[0020]步驟(I)中所述的蟹加工下腳料(包括蟹小腳及蟹背殼等)優(yōu)選用水沖洗I?3次，粉碎過(guò)20?50目篩；
[0021]步驟(I)中所述的蟹加工下腳料與異丙醇的質(zhì)量比優(yōu)選為10:(10?30);
[0022]步驟(I)中所述的回流加熱的條件優(yōu)選為:溫度為50?75°C，時(shí)間為20?35min；
[0023]步驟(I)中所述的清洗優(yōu)選為用水清洗I?3次；
[0024]步驟(I)中所述的干燥的條件優(yōu)選為40?65°C烘干至蟹加工下腳料水分含量5?10% ；
[0025]步驟(2)中所述的蟹粉與水的質(zhì)量比優(yōu)選為1:(18?25);
[0026]步驟(2)中所述的調(diào)整反應(yīng)體系pH值為8.2?9.0優(yōu)選采用0.1M的NaOH溶液調(diào)整pH值為8.2?9.0;
[0027]步驟(2)中所述的堿性蛋白酶的用量?jī)?yōu)選為2800?3500U/g蟹粉；
[0028]步驟(2)中所述的調(diào)整反應(yīng)體系pH值為6.5?7.5優(yōu)選采用0.1M HCl調(diào)整反應(yīng)體系pH值為6.5?7.5;
[0029]步驟(2)中所述的中性蛋白酶的用量?jī)?yōu)選為2000?2500U/g蟹粉；
[0030]步驟(2)中所述的離心的條件優(yōu)選為4000?8000轉(zhuǎn)/min離心10?20min;
[0031 ]步驟(3)中所述的超濾的操作壓力優(yōu)選為0.10?0.18MPa;
[0032]步驟(4)中過(guò)凝膠色譜SephadexG-25M柱的洗脫劑優(yōu)選為水；
[0033]步驟(5)中所述的濃縮優(yōu)選真空濃縮，真空濃縮的條件優(yōu)選為:50?60°C，真空度
0.080?0.090Mpa；
[0034]步驟(5)中所述的溶液真空濃縮后多肽含量?jī)?yōu)選為15%;
[0035 ]步驟(5)中所述的干燥優(yōu)選為冷凍干燥；
[0036]—種高抗氧化性蛋白肽，通過(guò)上述制備方法制備得到；
[0037]所述的高抗氧化性蛋白肽優(yōu)選低濕度保藏；
[0038]所述的高抗氧化性蛋白肽在食品和保健品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用；
[0039]所述的高抗氧化性蛋白肽的DPPH自由基清除率和超氧陰離子清除率分別達(dá)到23.5?27.5 %、21.2?24.8 %，抗氧化活性高，推廣利用的價(jià)值高；
[0040]本發(fā)明的原理:本發(fā)明對(duì)蟹加工下腳料脫脂后干燥以除去水分后，蟹肉蛋白能與蛋白酶充分接觸。脫脂干燥雖然影響蛋白結(jié)構(gòu)而降低了酶解速率，但脫脂干燥減少了酶解過(guò)程中脂肪氧化對(duì)抗氧化肽的影響，因此獲得較高的自由基清除率。脫脂干燥酶解的DPPH自由基清除率高于其他處理方式(微波預(yù)熱、蒸煮加熱及超聲波處理)。此外，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)對(duì)蛋白酶解液進(jìn)行組分分離及檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性最高的肽段分子量在1000?3700Da之間，因此采用能透過(guò)上述分子量的凝膠色譜填料Sephadex G-25M進(jìn)行過(guò)濾分離，得到高抗氧化性蛋白肽。
[0041]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0042]蟹加工后的下腳料包括蟹腳及背殼等，其中約含有10%?15%的蟹肉蛋白。對(duì)于這些殘肉若不進(jìn)行回收利用，一方面會(huì)造成蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)，另一方面也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。本發(fā)明通過(guò)蛋白酶高效水解，分離純化得到具有高抗氧化活性的特定蛋白質(zhì)肽段，產(chǎn)品品質(zhì)高，特別適合當(dāng)前的營(yíng)養(yǎng)和保健需求，是變廢為寶、綜合利用海洋蛋白資源的有效途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0044]實(shí)施例1
[0045](I)原料清洗及粉碎
[0046]取冷凍的蟹加工下腳料(包括蟹小腳及蟹背殼等)，解凍后用清水沖洗I次，粉碎至過(guò)20目篩；
[0047](2)預(yù)處理
[0048]取破碎過(guò)篩后的梭子蟹加工下腳料10kg，加入30L異丙醇，混合均勻后于75°C下回流加熱25min進(jìn)行脫脂，分離溶劑，不溶物用清水沖洗3次，然后于65°C烘干至水分含量10%，得到蟹粉；
[0049](3)蛋白酶水解處理
[0050]取步驟(2)制得的蟹粉100(^，加入180001^蒸餾水，混勻后加熱到62°(:，用0.謂的NaOH溶液調(diào)整pH值為8.2，然后按照2800U/g蟹粉的比例加入堿性蛋白酶，攪拌均勻后62°C保溫酶解2h;酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系加熱到1000C，保溫1min，使堿性蛋白酶失活;將反應(yīng)體系冷卻到45°C，用0.1M HCl調(diào)整pH值為6.5，然后按照2500U/g蟹粉的比例加入中性蛋白酶，45 °(:保溫酶解2h ；酶解結(jié)束后將反應(yīng)體系加熱到85°C，保溫15min，使酶失活;將上述反應(yīng)體系8000轉(zhuǎn)/min離心I Omin，得到上清液；
[0051](4)超濾
[0052]將步驟(3)制得的上清液加熱到50°C，然后通過(guò)能透過(guò)1kDa分子的超濾機(jī)進(jìn)行超濾，操作壓力為0.1OMPa，分離得到分子量小于1kDa的多肽溶液；
[0053](5)凝膠色譜過(guò)濾
[0054]將步驟(4)超濾得到的多肽溶液過(guò)凝膠色譜SephadexG-25M柱，用去離子水洗脫，收集得到分子量為1000?5000的多肽分子的溶液；
[0055](6)真空濃縮及干燥
[0056]將步驟(5)收集的溶液經(jīng)真空濃縮(50°C，真空度0.090Mpa)，使溶液中多肽分子含量達(dá)到15%，然后冷凍干燥，得到干態(tài)多肽物質(zhì)，即為高抗氧化性蛋白肽;該高抗氧化性蛋白肽低濕度保藏；
[0057]經(jīng)測(cè)定，通過(guò)上述方法得到的高抗氧化性蛋白肽，其DPPH自由基清除率和超氧陰離子清除率分別達(dá)到24.5%,21.2%,抗氧化活性高，推廣利用的價(jià)值高。
[0058]實(shí)施例2
[0059](I)原料清洗及粉碎
[0060]取冷凍的蟹加工下腳料(包括蟹小腳及蟹背殼等)，解凍后用清水沖洗2次，粉碎至過(guò)50目篩；
[0061 ] (2)預(yù)處理
[0062]取破碎過(guò)篩后的梭子蟹加工下腳料10kg，加入20L異丙醇，混合均勻后于60°C下回流加熱30min進(jìn)行脫脂，分離溶劑，不溶物用清水沖洗2次，然后于4