7.38(dd，J = 2.76,8.78Hz，lH)、6.88(d，J = 8.78Hz，lH)、4.12 (q，J = 7.03Hz，lH)、3.80(s，3H)、3.76(q，J = 6.00Hz，lH)、3.02(t，J = 6.53Hz，2H)、2.71(s， 6H)〇
[0151 ]實施例4.(方案2中的化合物)10的制備
[0152] 在（方案2中的化合物）8(2.93111111〇1，1等份）和（方案2中的化合物）9(3.28111111 〇1， 1.12等份)溶解于1，2-二氯乙烷的溶液中添加乙酸(3.28mmo 1，1.12等份）。在室溫下攪拌混 合物1小時，然后逐步添加溶于甲醇(30mL)的NaCNBH3(3.9mmo 1，1.3等份）。該混合物在室溫 下攪拌過夜。添加水(2mL)以終止反應。去除溶劑，并且(化合物）10的粗產(chǎn)品使用柱色譜通 過DCM/Me0H(90/10)進行純化。（化合物）10的化學結(jié)構(gòu)通過NMR確定，其純度通過HPLC和LC-MS確定。
[0153] 實施例5.(方案3中的化合物)13的制備
[0154] 將濃縮硫酸（7mL)逐滴添加到乙酸酐（80mL)和乙酸(40mL)的混合物中。使用冰浴 冷卻混合物。添加4-甲苯磺酰胺ll(12g，70mm 〇l)并將反應溫度維持在低于5°C。分批次添加 氧化鉻（8g，80mmol)。然后將反應混合物在5-10°C下攪拌4小時，然后將溶液倒在冰水中 (500mL)。使用DCM(3 X 100mL)萃取水溶液。使用鹵水沖洗組合有機相，通過無水硫酸鈉干燥 該組合有機相并將其濃縮從而獲得作為黃色油的(4-氨磺酰苯基)亞甲基二醋酸酯12。
[0155] 將在最后步驟中獲得的所述黃色油溶于乙醇（lOmL)中。添加水（lOmL)和濃縮的硫 酸(2mL)。將反應混合物加熱至回流并攪拌2小時。濃縮溶劑并用水(50mL)稀釋殘留物。使用 乙酸乙酯(2 X 20mL)萃取水溶液。通過硫酸鈉干燥該組合有機相并將其濃縮。通過硅膠柱純 化殘留物(洗脫液：己烷/EA 3:1至1:1)以獲得作為白色固體的（化合物）13 (1.5g，12 %收 率）：1H NMR(400MHz，DMSO)Sl〇.〇9(s，1H)、8.10((1, J = 8.3Hz，2H)、8.03((1, J = 8.3Hz，2H)、 7.59(s，2H)〇
[0156] 實施例6.(方案3中的化合物)16的制備
[0157] 在溶解于乙醇（15mL)的5-氯-2-甲氧基苯甲酸14(500mg，2.68mmol)的溶液中添加 濃縮的硫酸(O.lmL)。在回流下加熱混合物8小時。在真空下濃縮溶劑。使用乙酸乙酯稀釋殘 留物，以及使用飽和NaHC0 3溶液和鹵水沖洗溶液。通過硫酸鈉干燥有機相，并將其濃縮從而 獲得作為無色油的乙基5-氯-2-甲氧基苯甲酸鹽15。
[0158] 使用乙醇（1〇111〇稀釋上述無色油。添加無水肼（25811^，8.041]11]1〇1)。在回流下加熱 反應混合物整夜，然后允許其冷卻至室溫。形成白色針狀晶體，并通過過濾對其進行收集。 使用乙醇對晶體進行洗滌，并干燥以提供期望的產(chǎn)品16 ( 3 3 0 m g，61 %收率）：1Η N M R (400MHz，DMS0)S9.30(s，lH)、7.61(d，J = 2.8Hz，lH)、7.49(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.15(d， J = 8.9Hz，lH)、4.54(s，2H)，3.86(s，3H)。
[0159]實施例7.(方案3中的化合物)17的制備
[0160]在(方案 3 中的化合物）13(2001^，1111111〇1)和(方案3中的化合物）16(21711^，1111111 〇1) 溶解于乙醇(5mL)的懸浮液中添加一滴乙酸。在回流下加熱該混合物過夜。通過過濾收集沉 淀物，并用乙醇(2X5mL)沖洗所述沉淀物。干燥所述白色固體以獲得期望的產(chǎn)品17(353mg， 96%收率）：? NMR(400MHz，DMS0)Sll.72(s，lH)、8.38(s，lH)、7.92-7.86(m，4H)、7.60((1,J = 3.1Hz，lH)、7.56(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.43(s，2H)、7.21(d，J = 8.9Hz，lH)、3.87(s， 3H)〇
[0161] 實施例8.(方案3中的化合物)18的制備
[0162] 將(方案3 中的化合物）17 (200mg，0 · 54mmo 1)和NaBH3CN( 5 lmg，0 · 82mmo 1)溶于丁冊-MeOH (v/v 1:1，6mL)的懸浮液在室溫下攪拌24小時。使用濃縮的鹽酸（lmL)終止反應。然后， 使用飽和的NaHC03溶液使混合物堿化。形成白色沉淀物并通過過濾收集所述白色沉淀物。 使用水沖洗白色固體，并對其進行干燥以提供期望的產(chǎn)品18(178mg，89 %收率）：咕匪R (400MHz，丙酮）δ9.26((1, J = 5.6Hz，1H)、7.95((1, J = 2.8Hz，lH)、7.89((1, J = 8.4Hz，2H)、 7.62(d，J = 8.4Hz，2H)、7.49(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.18(d，J = 8.9Hz，lH)、6.56(s，2H)、 5.54(d，J = 6.0Hz，lH)、4.17(d，J = 4.5Hz，2H)、3.92(s，3H)。
[0163] 實施例9.對NLRP3炎性小體的抑制可以限制缺血-再灌注之后的心肌損傷
[0164] 簡介
[0165] 在急性心肌梗塞(AMI)期間會發(fā)生強烈的炎癥反應，該反應的強度可以預測不利 的結(jié)果。缺血性壞死期間胞內(nèi)物的分泌會導致在白血球和駐留細胞(resident ce 11 s)包括 心肌細胞（圖1)中形成大分子結(jié)構(gòu)和炎性小體。在損傷期間炎性小體的活化會通過促進白 介素 lf3(IL-lf3)的分泌和細胞死亡而極大地放大炎癥反應。NLRP3(NALP3或cryopyrin)是細 胞內(nèi)感受器的一種，Nod樣受體(NLR)家族的一部分，會引起炎性小體的形成和半胱天冬酶-1的活化。在細胞死亡期間，細胞外ATP導致K+從細胞中流出，以及隨后NLRP3的活化。小鼠中 NLRP3的沉默或基因刪除限制了試驗中AMI的梗塞面積，表明NLRP3炎性小體可以作為藥物 抑制的可用(viable)標革巴。
[0166] NLRP3在炎癥疾病中的中心作用在Cryopyrin相關的周期綜合征(CAPS)中非常顯 著，所述CAPS是這類病癥:其中組成性激活型（constitutively active)NLRP3由于點突變 而導致炎性小體不能控制的活化，從而導致嚴重的、經(jīng)常致命的炎癥疾病。然而，臨床上可 購的NLRP3抑制劑是短缺的。格列本脲，作為一種廣泛使用的抗糖尿病藥物(磺酰脲類），具 有體外NLRP3抑制性活性，但是格列本脲作為體內(nèi)抑制劑的應用需要非常高的劑量，例如比 在糖尿病中的使用高數(shù)百倍，其不可避免地與致命的低血糖相關。
[0167] 格列本脲分子中的環(huán)己基脲部分通過抑制KATP通道從而涉及胰腺細胞中胰島素 的分泌，然而其對于NLRP3抑制效應并不是必須的。該實施例描述了 16673-34-0對NLRP3炎 性小體活性的抑制效應，16673-34-0為合成格列本脲的中間物質(zhì)，它不包含涉及胰島素分 泌的環(huán)己基脲部分。16673-34-0在此處也被稱為式III的化合物，其是上述方案I中的化合 物5 〇
[0168] 方法
[0169]設計并合成格列本脲類似物。已經(jīng)證實最近報道的一種包含磺酰氯基團的類似物 (化合物1，圖2)保留了格列本脲的一部分抗炎癥活性，并且對胰島素沒有作用（Lamkanfi 等，J Cell Biol 2009;18761-18770)。然而，化合物1包含具有化學反應性的磺酰氯部分， 其可能使得化合物1成為非選擇性的cryopyrin炎性小體抑制劑。因此，設計了化學性質(zhì)穩(wěn) 定的類似物2和3以評估磺胺劑和磺酸部分能否保留其對cryopyrin炎性小體的抑制活性。 [0170]化合物2和3的合成按照方案1(圖3)中所示進行。簡而言之，4(5-氯-2-甲氧基苯甲 酸)和5(2-苯乙胺）（兩種物質(zhì)可以在市場上獲得)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二 亞胺(EDCI)存在下的偶聯(lián)反應，提供(化合物)6(酰胺中間產(chǎn)物，5-氯-2-甲氧基-N-(2-苯乙 基)-苯甲酰胺）。通過先向（化合物)5中添加氯磺酸，然后在85°C下加熱，實現(xiàn)(化合物)6的 磺化以形成(化合物）1。通過使(化合物）1與ΝΗ 40Η進行反應來制備磺胺類似物2(5-氯-2-甲 氧基-N-[ 2-(4-磺酰胺基苯基)-乙基]-苯甲酰胺（16673-34-0))。（化合物）1在H20回流條件 下的水解以較好的收率獲得磺酸3。
[0171 ]體外炎性小體形成的測定
[0172] J774A.1細胞，小鼠巨噬細胞株，通過添加了 10%胎牛血清(FBS)(Sigma_Aldrich， 圣路易斯市，密蘇里州）的RPMI(洛斯維帕克紀念研究所)培養(yǎng)基(aiBCO?,中央格蘭德島， 紐約）以5 X104細胞/孔的密度在培96多孔板中培養(yǎng)接種24小時。使用大腸桿菌0111 :B4月旨 多糖(LPS) (25]^/1]11^;3丨81]^-41(11'；[(311)(]^8/1111)啟動(口1'；[1116)細胞4小時，然后使用41?(51111) 處理30分鐘以誘導NLRP3炎性小體的形成。收集上清液，使用小鼠 IL-lffiLI SA試劑盒(賽默 飛世爾科技，普林斯頓，新澤西州）測量IL-β的水平。為了測試16673-34-0對NLRP3炎性小體 活化的抑制效應，使用16673-34-0(400μΜ)或格列本脲(400μΜ)在ATP處理30分鐘時共同處 理細胞，并讀取IL-Ιβ水平。
[0173] 在獨立的實驗中，使用永生化成年鼠心肌細胞(HL-1)。使用建議的Claycomb培養(yǎng) 基（西格瑪奧德里奇公司）培養(yǎng)細胞(Claycomb等，n Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: 2979-2984)，然后如前所述使用LPS(25ng/mL)引發(fā)細胞2小時，接著用ATP(5mM)處理1小時， 用于誘導NLRP3炎性小體的形成（Mezzaroma等，Proc Natl Acad Sci USA 2011;108: 19725-19730)。然后使用16673-34-0(400μΜ)或格列本脲(400μΜ)在LPS引發(fā)階段處理HL-1 細胞，然后用ATP處理。使用前述ASC聚集(免疫組織化學）、半胱天冬酶-1活性(酶活性)和細 胞死亡（臺盼藍染色排除法)測定和定量HL-1細胞中NLRP3炎性小體的形成。簡而言之，在實 驗之前，針對免疫組織化學，在35-mm培養(yǎng)皿中將2.5 X 105個HL-1細胞接種于24 X 24mm涂覆 有明膠/纖維連接蛋白（0.02-0.5%)的蓋玻片上。ASC表達以外接細胞質(zhì)核周聚集被檢測， 以及表示為每個視野中全部細胞中的ASC-+細胞，通過兩組不同的研究人員對ASC聚集進行 盲定量。關于NLRP3炎性小體活化的讀取，評估半胱天冬酶-1的酶活性和細胞死亡。簡而言 之，HL-1細胞(2X10 6個細胞)接種于90-mm培養(yǎng)皿中，如上所述誘導NLRP3炎性小體的形成。 在處理之后，為測量半胱天冬酶-1的活性，沖洗、回收和冷凍細胞。使用包含蛋白酶抑制劑 (西格瑪奧德里奇公司）的混合物的RIPA緩沖液(西格瑪奧德里奇公司）重懸細胞球粒，然后 在16,200 Xg下離心20分鐘。收集上清液，使用Bradford法對蛋白質(zhì)含量進行定量。通過測 量由于熒光底物的裂解而產(chǎn)生的熒光來測定半胱天冬酶-1的活性。熒光被報道為lyg樣品 每分鐘產(chǎn)生的任意熒光單元(熒光/yg/min)。使用臺盼藍染色排除法測定HL-1心肌細胞的 細胞死亡。簡而言之，對HL-1細胞進行上述處理，收集并重懸于lml的Claycomb培養(yǎng)基中，接 著用100yL0.4%的臺盼藍溫育染色，在室溫下溫育5分鐘。臺盼藍陽性細胞被認為是不能存 活的，細胞死亡的比例測定為每個視野(field)中臺盼藍陽性細胞占所有細胞數(shù)的比例。我 們也使用20μΜ尼日利亞菌素 (Enzo Life Sciences Inc，法明代爾，紐約），其為一種成孔毒 素，使得K+以與ATP結(jié)合P2X7受體相似的方式從細胞中流出。為了測定NLRP3炎性小體的特 異性以及排除其他炎性小體的效果，將HL-1細胞（IX 106)接種于35mm培養(yǎng)皿中，并用鞭毛 蛋白或聚-脫氧腺苷-脫氧胸苷酸鈉鹽(聚(dA:dT))處理以分別誘導不參與NLRP3感受器活 化的NLRC4和AM2炎性小體。將0.7ug/ml的從鼠傷寒沙門氏菌14028中分離的鞭毛蛋白（恩 佐生命科學，法明代爾，紐約）添加到Claycomb培養(yǎng)基中（不含胎牛血清(FBS))。為了誘導 NLR(34炎性小體，先通過Ρο 1 yp 1 u s轉(zhuǎn)染試劑盒（P U LSin S'.,紐約