添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高分子聚合物在當(dāng)今世界乃至未來(lái)都充當(dāng)著舉足輕重的角色，尤其是在開(kāi)發(fā)新型替代能源方面，在節(jié)約資源、能源和保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面更是發(fā)揮著不可替代的作用。新時(shí)代的高分子聚合物更是與各行各業(yè)密不可分，科學(xué)家將在更多方面探究高分子聚合物，與時(shí)代低碳節(jié)能的生活相呼應(yīng)，高分子聚合物與產(chǎn)品也會(huì)越來(lái)越適應(yīng)這時(shí)代的主題。事實(shí)表明，高分子聚合物在近幾年取得了飛速的發(fā)展，許多重要的高分子聚合物相繼實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。
[0003]聚蘋(píng)果酸是以蘋(píng)果酸為唯一單體合成的均聚高分子聚合物，具有優(yōu)良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等獨(dú)特性質(zhì)，其次，它作為一種水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化學(xué)衍生性。聚蘋(píng)果酸的這些性質(zhì)，使其在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理以及香精香料等許多方面有著廣闊的應(yīng)用前景。生物法合成聚蘋(píng)果酸具有成本低、合成條件溫和、產(chǎn)物的分子量相對(duì)較高等優(yōu)點(diǎn)，因此生物法合成聚蘋(píng)果酸具有很好的開(kāi)發(fā)前景。
[0004]氧載體是一種與水不互溶、對(duì)微生物無(wú)毒、具有較高溶氧能力的物質(zhì)。氧載體由于具有氧傳遞速度快，能耗低，氣泡生成少，剪切力小等優(yōu)點(diǎn)。本文選用H2O2作為氧載體來(lái)促進(jìn)聚蘋(píng)果酸的合成，它通過(guò)促進(jìn)氧傳遞來(lái)提高溶氧，從而有助于聚蘋(píng)果酸的合成。
[0005]目前文獻(xiàn)當(dāng)中有關(guān)提高聚蘋(píng)果酸產(chǎn)量的方法主要是通過(guò)菌種誘變以及培養(yǎng)基成分優(yōu)化，往往效果不太明顯，發(fā)酵周期長(zhǎng)，且底物的轉(zhuǎn)化率不高，導(dǎo)致聚蘋(píng)果酸成本居高不下。還有一些專利是通過(guò)改變發(fā)酵方式和添加生長(zhǎng)因子來(lái)提高產(chǎn)量。如申請(qǐng)?zhí)枮?01410830995.4的發(fā)明專利采用補(bǔ)料發(fā)酵的方法提高聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，產(chǎn)量提高了 11-20%，但至今也沒(méi)有通過(guò)添加氧載體來(lái)促進(jìn)合成的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法。
[0007]本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是:
本發(fā)明的添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法，使用菌種為出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，該菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC7055；
制備過(guò)程具體包括以下步驟:
(I)種子培養(yǎng)
將出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸浮液;按照體積比10%的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有10ml種子培養(yǎng)基的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20-30 0C，搖床轉(zhuǎn)速為180-230r/min，培養(yǎng)時(shí)間為35_45h ；
種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨lg/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1%v/V,K2CO3 0.4g/L,MgSO4.7H20 0.lg/L,KH2PO4 lg/L,ZnSO4.7H20 0.05g/L，其余為蒸餾水；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以8-12%v/v的量接于裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速280-320r/min，通風(fēng)比1:2，罐壓0.1-0.3Mpa，發(fā)酵進(jìn)行到35-50h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始流加發(fā)酵體積0.5-2%的1moVL的H2O2溶液，發(fā)酵周期為140-150ho
[0008]發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖180g/L，蛋白胨 35g/L，KH2P04 0.lg/L,NaNO3 2g/L,MgSO4.7H20 0.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余為蒸餾水。
[0009]本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施:
使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，首先將含有聚蘋(píng)果酸且去除菌體的發(fā)酵液水解，用高效液相色譜法測(cè)定其中蘋(píng)果酸的含量，從而得出聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量。
[0010]H2O2溶液的體積比濃度為0.5-4%。
[0011 ]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
本發(fā)明的添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法中，包括利用出芽短梗霉菌株的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)兩個(gè)步驟，在發(fā)酵進(jìn)行到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)流加H2O2溶液促進(jìn)溶氧速率，從而提高聚蘋(píng)果酸的合成效率，較大地提高了底物的轉(zhuǎn)化率，降低了生產(chǎn)成本，提高了效率。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
本發(fā)明的添加氧載體制備聚蘋(píng)果酸的方法，使用菌種為出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans，該菌種已于2012年12月25日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC7055;
制備過(guò)程具體包括以下步驟:
(1)種子培養(yǎng)
將出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸浮液;按照體積比10%的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有10ml種子培養(yǎng)基的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20-30 0C，搖床轉(zhuǎn)速為180-230r/min，培養(yǎng)時(shí)間為35_45h ；
種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨lg/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1%ν/ν，其中v/v指的是玉米漿與種子培養(yǎng)基的體積比，K2CO3 0.4g/L，MgS04.7H20 0.lg/LjKH2PO4 lg/L,ZnSO4.7H20 0.05g/L，其余為蒸餾水;
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以8-12%v/v的量接于裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速280-320r/min，通風(fēng)比1:2，罐壓0.1-0.3Mpa，發(fā)酵進(jìn)行到35-50h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始流加發(fā)酵體積0.5-2%的1moVL的H2O2溶液，發(fā)酵周期為140-150ho
[0013]發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖180g/L，蛋白胨 35g/L,KH2PO4 0.lg/L,NaNO3 2g/L,MgSO4.7H20 0.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余為蒸餾水。
[0014]使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的含量測(cè)定，首先將含有聚蘋(píng)果酸且去除菌體的發(fā)酵液水解，用高效液相色譜法測(cè)定其中蘋(píng)果酸的含量，從而得出聚蘋(píng)果酸的產(chǎn)量。
[0015]H2O2溶液的體積比濃度為0.5-4%。
[0016]未流加H2O2溶液的空白對(duì)照例:
(1)種子培養(yǎng)
將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化2h，用無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，制得孢子懸液;按照10%的接種量接到含有10ml種子培養(yǎng)基的500ml擋板瓶中，培養(yǎng)溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h;
種子培養(yǎng)基組成為:蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，硫酸銨lg/L，丁二酸2g/L，玉米漿0.1%v/V,K2CO3 0.4g/L，MgS04.7H20 0.lg/L,KH2PO4 lg/L,ZnSO4.7H20 0.05g/L，其余為蒸餾水；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以10%( v/v)的量接于裝有3L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速300r/min，通風(fēng)比1:2，罐壓0.1Mpa，發(fā)酵周期為144h ；
發(fā)酵培養(yǎng)基為:蔗糖 180g/L，蛋白胨 35g/L,KH2PO4 0.lg/L,NaNO3 2g/L,MgSO4.7H200.3g/L，KCl 0.5g/L，MnSO4 0.05g/L，其余為蒸餾水。
[0017](3)聚蘋(píng)果酸的測(cè)定
使用高效液相色譜法進(jìn)行聚蘋(píng)果酸的