一種基于控制菌絲體結(jié)構(gòu)改善檸檬酸發(fā)酵性能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于控制菌絲體結(jié)構(gòu)改善巧樣酸發(fā) 酵性能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧樣酸kitric acid),又名構(gòu)緣酸，是當(dāng)今利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的一種極為重要的工 業(yè)有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等重要領(lǐng)域。巧樣酸的主流生產(chǎn)方式為液體深層 發(fā)酵，所用菌種為黑曲霉(Aspergillus niger);工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中普遍采用二級(jí)發(fā)酵方 式，即首先采用成熟的黑曲霉抱子懸液接種種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，抱子經(jīng)過(guò)吸水膨脹，培養(yǎng)至8 h開(kāi)始萌發(fā)，長(zhǎng)出芽體，培養(yǎng)24~32 h，制備成熟的種子，然后將成熟的種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)。 成熟的黑曲霉抱子制備過(guò)程復(fù)雜，一般經(jīng)過(guò)平板篩選，斜面一茄子瓶一教曲桶等逐級(jí)擴(kuò)大 培養(yǎng)過(guò)程，制備過(guò)程繁瑣，制備周期至少需要30 dW上。
[0003] 巧樣酸發(fā)酵過(guò)程中的菌絲球體，是由一個(gè)或數(shù)個(gè)抱子在生長(zhǎng)過(guò)程中物理作用形成 的，菌絲體的大小數(shù)量關(guān)系到發(fā)酵的成敗。一般菌絲球體越小、數(shù)量越多越有利于巧樣酸的 積累。抱子接種數(shù)量會(huì)顯著影響菌絲體大小和數(shù)量，接種抱子數(shù)與菌球體數(shù)量成正比，接種 抱子數(shù)不足會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)酵效果。巧樣酸發(fā)酵是一個(gè)高度耗氧的過(guò)程，氧氣供應(yīng)是影響巧 樣酸合成的限制步驟，而氧氣的傳輸是從溶液中溶解氧傳遞至菌絲細(xì)胞中；菌絲纏繞致密 的菌絲球，氧的傳輸僅僅發(fā)生在菌絲球表面，而菌絲疏松的菌絲球的氧氣供應(yīng)充分，巧樣酸 合成速率較快。此外，菌絲球體的菌絲內(nèi)部結(jié)構(gòu)也會(huì)對(duì)巧樣酸發(fā)酵產(chǎn)生重要影響。
[0004] 然而，至今未有一種控制菌絲球菌絲結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單有效的方法，并W此改善發(fā)酵性 能，提高巧樣酸產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述空白，本發(fā)明的目的在于提供一種基于控制菌絲體結(jié)構(gòu)改善 巧樣酸發(fā)酵性能的方法，該方法可獲得有利于巧樣酸合成的特定結(jié)構(gòu)菌絲體形態(tài)，改善發(fā) 酵性能，提高巧樣酸產(chǎn)量。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案:一種基于控制菌絲體結(jié)構(gòu)改善巧 樣酸發(fā)酵性能的方法，包括W下步驟:將培養(yǎng)成熟的黑曲霉抱子配制成抱子懸液，接種至種 子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng);在種子培養(yǎng)過(guò)程中，提高攬拌轉(zhuǎn)速擾動(dòng)抱子萌發(fā)與菌絲纏繞過(guò)程， 獲得成熟種子液;將上述成熟種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)束發(fā)酵。
[0007] 具體地，所述黑曲霉抱子接種后的終濃度為20~80萬(wàn)個(gè)/ mL。
[0008] 具體地，所述提高攬拌速度擾動(dòng)的工藝是在所述種子培養(yǎng)進(jìn)行6~20 h啟動(dòng)的，將 攬拌轉(zhuǎn)速提高至800~1200巧m。
[0009] 具體地，所述種子培養(yǎng)時(shí)間為24~32 h，獲得成熟種子液。
[0010] 優(yōu)選地，當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基還原糖濃度低于0.5%時(shí)結(jié)束發(fā)酵。
[0011] 具體地，所述種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基由淀粉質(zhì)原料配制，所述淀粉質(zhì)原料包括玉 米粉、小麥粉、木馨粉、紅馨粉、淀粉、糖蜜、小麥中的至少一種。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果： 本發(fā)明基于萌發(fā)過(guò)程抱子聚集與菌絲球纏繞對(duì)外加剪切力的敏感性不同，通過(guò)在種子 培養(yǎng)至特定階段(6~20 h)啟動(dòng)機(jī)械擾動(dòng)的方式，擾動(dòng)抱子萌發(fā)和菌絲纏繞過(guò)程，增大萌發(fā) 菌絲之間的碰撞幾率，形成直徑更小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加疏松的菌絲球體，同時(shí)斷裂的菌絲體會(huì) 重新纏繞形成新的菌球體，有利于溶氧與傳質(zhì)，發(fā)酵性能得W顯著提升(發(fā)酵周期縮短，發(fā) 酵產(chǎn)酸量、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率及發(fā)酵指數(shù)提高）;此外，擾動(dòng)作用增加了菌絲球數(shù)量，相同條件下可 降低抱子使用量，降低了生產(chǎn)成本，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng) 用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為種子液菌絲球在光學(xué)顯微鏡50倍下的形態(tài)特征圖，其中，a:對(duì)比例，b:本發(fā)明實(shí) 施例1。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0015] 在W下實(shí)施方式中，總糖、還原糖的測(cè)定方法采用菲林滴定法，巧樣酸的測(cè)定采用 濃度0.1429 mol/L的化0H滴定，抱子計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板;如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域常 用設(shè)備和工藝方法。
[0016] 所用原料和試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為市售通用產(chǎn)品。
[0017] 實(shí)施例1 玉米粉與水按照1:3比例混合均勻，高溫淀粉酶添加量為25 U/g玉米粉，二次噴射液 化，其中一噴溫度為97 °C，二次噴射溫度127 °C，經(jīng)艦試合格，得到液化混液，部分液化混液 經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾得到液化清液;液化混液與水混合均勻，添加一定量的硫酸錠配制種子培養(yǎng) 基(總糖10%，總氮0.30%);液化混液，液化清液與水混合配制發(fā)酵培養(yǎng)基(總糖16.4%，總氮 0.08%);成熟的抱子懸液W濃度20萬(wàn)個(gè)/mL接種種子培養(yǎng)基，攬拌轉(zhuǎn)速600巧m，培養(yǎng)至6 h 時(shí)，攬拌轉(zhuǎn)速提高至800 rpm，擾動(dòng)抱子萌發(fā)與菌絲纏繞過(guò)程，繼續(xù)培養(yǎng)至32 h獲得成熟的 種子液，然后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，當(dāng)發(fā)酵還原濃度低于0.5%時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵周期50 h，測(cè)得 發(fā)酵產(chǎn)酸16.02%，糖酸轉(zhuǎn)化率100.1%。
[001引 實(shí)施例2 同實(shí)例1，玉米粉與水按比例混合均勻，經(jīng)過(guò)二次噴射得到玉米粉液化混液，經(jīng)過(guò)板框 過(guò)濾得到玉米粉液化清液，玉米粉液化混液與水混合均勻并添加一定量硫酸錠配制種子培 養(yǎng)基(總糖10%，0.28%)。紅馨粉與65°C水按照1:3比例混合，調(diào)節(jié)抑6.0，按照35 U/g添加耐 高溫淀粉酶，經(jīng)二次噴射液化，經(jīng)艦試合格，獲得紅馨液化混液，經(jīng)板框過(guò)濾得到紅馨液化 清液。玉米粉液化清液，紅馨液化清液與水按照一定比例混合配制發(fā)酵培養(yǎng)基(總糖16.8%， 總氮0.10%);成熟的抱子懸液W 50萬(wàn)個(gè)/mL接種種子培養(yǎng)基，攬拌轉(zhuǎn)速600巧m，培養(yǎng)至12h 時(shí)，攬拌轉(zhuǎn)速提高至900 rpm，擾動(dòng)抱子萌發(fā)與菌絲纏繞過(guò)程，繼續(xù)培養(yǎng)至28 h獲得成熟的 種子液，然后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，當(dāng)發(fā)酵還原濃度低于0.5%時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵周期53 h，測(cè)得 產(chǎn)酸量16.9%，糖酸轉(zhuǎn)化率100.6%。
[0019] 實(shí)施例3 小麥粉與水按照1: 3比例混合均勻，高溫淀粉酶添加量為28 U/g小麥粉，二次噴射液 化，其中一噴溫度為99°C，二次噴射溫度125°C，經(jīng)艦試合格，得到小麥粉液化混液，部分液 化混液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾得到小麥粉液化清液