一種制備卡貝縮宮素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種固液相結(jié)合合成多肽的方法，尤其是卡貝縮宮素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 預(yù)防宮縮乏力產(chǎn)后出血除了按摩子宮外，主要使用收縮子宮的藥物。宮縮劑常用 縮宮素、麥角新堿、前列腺素制劑，各種藥物均有其優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)?？s宮素使用最廣泛，優(yōu)點(diǎn)是 起效快，安全、副反應(yīng)小，缺點(diǎn)是作用時(shí)間短，半衰期為卜6 min，其作用的發(fā)揮依賴于體內(nèi) 的縮宮素受體，當(dāng)受體飽和后，無(wú)限制加大用量反而效果不佳，并出現(xiàn)副反應(yīng)，24 h總量應(yīng) 控制在60 u內(nèi)。因?yàn)橐陨显?，催產(chǎn)素有時(shí)作用有限。麥角新堿對(duì)子宮體、子宮下段及子宮 頸均有收縮作用，可引起全子宮強(qiáng)直性收縮，但收縮子宮的同時(shí)可使血管平滑肌收縮，可引 起血壓升高，禁用于心血管疾病，國(guó)內(nèi)目前斷貨。常用前列腺素制劑有米索前列醇和卡前列 素氨丁三醇:米索前列醇系前列腺素 E1的衍生物，可引起全子宮有力收縮，但副反應(yīng)較大， 惡心、嘔吐、腹瀉、寒戰(zhàn)和體溫升高較常見(jiàn);青光眼、哮喘及過(guò)敏體質(zhì)者禁用?？ㄇ傲兴匕倍?三醇(商品名：欣母沛）：為前列腺素 F2ct衍生物（15-甲基FGF2a)，也可引起全子宮協(xié)調(diào)有力 的收縮，作用效果較明顯，單劑量注射后作用持續(xù)15~30 min。副反應(yīng)較米索前醇輕，但價(jià)格 較昂貴，目前約600元1支，價(jià)格限制了它的廣泛應(yīng)有，目前主要用于難治性產(chǎn)后出血。
[0003] 卡貝縮宮素是一種合成的具有激動(dòng)劑性質(zhì)的長(zhǎng)效催產(chǎn)素九肽類(lèi)似物，它的臨床和 藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類(lèi)似，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其 頻率和增加子宮張力。卡貝縮宮素對(duì)非妊娠的子宮沒(méi)有作用，僅對(duì)妊娠子宮和剛生產(chǎn)的子 宮具有有效的子宮收縮作用。靜脈推注后子宮迅速收縮，可在2 min內(nèi)達(dá)到一個(gè)明確強(qiáng)度， 半衰期為40 min，明顯長(zhǎng)于縮宮素。本研究顯示，卡貝縮宮素組產(chǎn)后2 h出血量和產(chǎn)后24 h 出血量明顯少于縮宮素組，產(chǎn)后出血率低于縮宮素組，與國(guó)內(nèi)其他研究相符?？ㄘ惪s宮素療 效高于縮宮素的最主要原因是其作用時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)后2 h是產(chǎn)婦最容易出血的時(shí)間，縮宮素由 于其半衰期短，作用時(shí)間也短，而單劑量靜脈注射100 yg卡貝縮宮素對(duì)子宮的活性作用可 持續(xù)1 h以上，明顯長(zhǎng)于普通縮宮素，故作用效果更好。由于其作用時(shí)間長(zhǎng)，除少數(shù)對(duì)縮宮素 不敏感者，很少需要再加用其他藥物，有研究表明，在剖官產(chǎn)分娩后降低產(chǎn)后出血發(fā)生率方 面，單次靜脈給藥1〇〇 yg至少與連續(xù)16 h靜脈滴注催產(chǎn)素的效果相當(dāng)。
[0004] 在副作用方面，使用卡貝縮宮素少數(shù)可見(jiàn)惡心、嘔吐、腹痛、瘙癢、面紅、低血壓、頭 痛、口腔金屬味，但程度很輕，無(wú)需處理。本研究每個(gè)病例僅使用1支，未見(jiàn)嚴(yán)重副反應(yīng)病例， 重復(fù)使用有待進(jìn)一步研究。目前卡貝縮宮素市場(chǎng)價(jià)格約320元，較欣母沛低，患者容易接受。 綜上所述，卡貝縮宮素具有高效、安全、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣。
[0005] 卡貝縮宮素分子結(jié)構(gòu) 1? \J\ I N μ J n -?Η α μ J I|J'J l±l \ ' r
η ΠΑ? μ ZX.^1 η μ=?) /| μ I|J'J |dt| yj J-v ? 式步驟多，要求合成人員經(jīng)驗(yàn)豐富，每步驟純化能力強(qiáng)，同時(shí)耗時(shí)耗力，不利于多肽的大規(guī) 模生產(chǎn)。
[0006] 在較為近期的中國(guó)專(zhuān)利（公開(kāi)號(hào)CN101555272A)公開(kāi)了一種卡貝縮宮素的固相制 備方法，較為先進(jìn)，但是仍有不足：1，收率低，專(zhuān)利公開(kāi)收率為45%，一般收率可達(dá)30%較為正 常;2，純化成本高，液相填充柱本身價(jià)格很貴，利用高效液相色譜洗脫也要用大量的乙腈和 水沖洗;造成收率低的根本原因一方面是因?yàn)楹u化合物縮合后切割過(guò)程中即與分子內(nèi)或 者分子間的其他基團(tuán)反應(yīng)生成雜質(zhì)，另一方面是因?yàn)樵谝合嗌V柱中由于雜質(zhì)相近而導(dǎo)致 純化過(guò)程中損耗過(guò)大。
[0007] 本發(fā)明提前將鹵化物和巰基反應(yīng)，反應(yīng)完后將鹵代物清洗干凈有效的避免了副反 應(yīng)，采用高效逆流色譜分離進(jìn)行無(wú)損分離，大大提高收率和操作方便度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為提高卡貝縮宮素的合成收率，提高合成質(zhì)量，本發(fā)明公開(kāi)了一種方便快捷，易于 大規(guī)模生產(chǎn)的卡貝縮宮素制備方法，主要解決現(xiàn)有制備方法存在的收率低、純化成本高的 技術(shù)問(wèn)題。
[0009] -種制備卡貝縮宮素的方法，包括以下步驟：1)由氨基樹(shù)脂通過(guò)偶聯(lián)劑依次與 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Cys(Alloc)-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fm 〇C-Ile-OH偶聯(lián)得到樹(shù)脂多肽;2)脫半胱氨酸保護(hù);3)堿性條件下與4-鹵基 丁酸反應(yīng)，與H-Tyr(0Me)-0tBu偶聯(lián);4)切割多肽，液相關(guān)環(huán);5)粗肽經(jīng)高效逆流色譜純化， 凍干得到卡貝縮宮素。
[0010] 所用氨基樹(shù)脂為Rink amide樹(shù)脂，替代度為0.4mmol/g~1.2mmol/g。
[0011] 所用偶聯(lián)試劑為 DIC/H0Bt、DIC/H0At、PyB0P/H0Bt、TBTU/H0Bt、HBTU/H0BtSHATU/ HOAt中的一種。
[0012]脫除半胱氨酸加保護(hù)試劑，為四三苯基膦鈀，苯硅烷和二氯甲烷混合溶劑（四三苯 基膦鈀為樹(shù)脂多肽物質(zhì)的量的3%，苯硅烷:二氯甲烷體積比=1: (10~20))，4_鹵代丁酸為4-溴丁酸或4-氯丁酸。
[0013] 步驟3)具體為，將脫巰基保護(hù)劑的樹(shù)脂多肽轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入 DMF溶劑，加入1.5~5倍量(脫巰基保護(hù)劑的樹(shù)脂多肽物質(zhì)量為基準(zhǔn))有機(jī)堿N-甲基嗎啉，開(kāi) 啟攪拌，冰浴，滴加1.1~4倍量(脫巰基保護(hù)劑的樹(shù)脂多肽物質(zhì)量為基準(zhǔn))4_鹵代丁酸DMF溶 液，反應(yīng)0.1~2小時(shí)，過(guò)濾，DMF和甲醇輪換洗滌;與H-Tyr (OMe) -OtBu偶聯(lián)，偶聯(lián)劑采用前述 偶聯(lián)劑。
[0014] 步驟4 )具體為：先由哌啶溶液脫Fmoc保護(hù)基，再用TFA溶液將多肽切割保護(hù)基脫 除，離心，傾出溶液，粗肽溶于DCM，冰浴加 HOSu，與DCC環(huán)合，濾出固體，低溫旋干DCM，正丁醇 溶解多肽，稀碳酸氫鈉溶液洗滌得，卡貝縮宮素粗肽正丁醇溶液。
[0015] 純化方法采用高效逆流色譜，萃取劑為甲醇：正丁醇：水:醋酸體積比=(1~4) : (1~ 6): (1~5): (0.01~1)，根據(jù)高效色譜液相質(zhì)譜確定出峰時(shí)間，收集卡貝縮宮素醋酸鹽純肽混 合溶液，乙醚萃取洗掉正丁醇，卡貝縮宮素醋酸鹽純肽水溶液凍干，得卡貝縮宮素產(chǎn)品。
[0016] 高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC )是 20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài) 的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性 流體動(dòng)力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相，在連續(xù)洗脫的過(guò)程中能保留 大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)， 因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回 收的樣品更能反映其本來(lái)的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離 物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分 離手段。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是:傳統(tǒng)的多肽純化是利用高效液相色譜法，物質(zhì)在填料中的 洗脫系數(shù)分離，在操作需要大量的高純乙腈，操作過(guò)程色譜柱的能力也有損耗，是一個(gè)昂貴 的耗材，并且化合物會(huì)在純化過(guò)程中有損耗。本發(fā)明采用高效逆流色譜是萃取得原理，沒(méi)有 填料，反應(yīng)產(chǎn)物從進(jìn)入儀器至產(chǎn)物分離經(jīng)過(guò)數(shù)千次萃取過(guò)程，并且無(wú)化合物殘留于儀器內(nèi)， 屬于無(wú)損純化，本發(fā)明優(yōu)化了萃取溶劑和萃取比例，得到了很好的收率。減少了巰基和鹵素 反應(yīng)的副產(chǎn)物，雜質(zhì)減少，純化難度降低，收率達(dá)65%，純度99%。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1本發(fā)明工藝流程圖。
[0019] 圖2為本發(fā)明產(chǎn)品色譜圖。
[0020] 圖3為本發(fā)明產(chǎn)品質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面給出實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根 據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出的一些分本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬本發(fā)明保護(hù)范圍； 說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)含義列于下表中：
保護(hù)氨基酸為本公司自產(chǎn)；
實(shí)施例1: Fm〇C-Gly-氨基樹(shù)脂的合成，參照?qǐng)D1， 將氨基樹(shù)脂142克，替代度為0.4mmol/g，加入到固相反應(yīng)柱中，加入DCM溶脹樹(shù)脂30分 鐘后，將 34 克 Fmoc-Gly-OH，43 克 HATU， 17克HOAt溶于自己DMF中冷卻至5°C，通氮?dú)夥磻?yīng)，加入13.7克TMP，室溫反應(yīng)50分鐘， DMF洗滌3次，DCM和甲醇輪換洗滌3次。
[0022]固相反應(yīng)器為砂性漏斗，下部連接三通，三通一端接氮?dú)馄?，三通另一端接抽濾瓶 和真空栗，方便通氮?dú)夂统闉V。
[0023]實(shí)施例2:Fm〇c-Gly-氨基樹(shù)脂的合成，參照?qǐng)D1， 將氨基樹(shù)脂142克，替代度為1.2mmol/g，加入到固相反應(yīng)柱中，加入DCM溶脹樹(shù)脂30分 鐘后，將 102 克 Fmoc-Gly-OH，129 克 HATU， 51克HOAt溶于自己DMF中冷卻至5°C，通氮?dú)夥磻?yīng)，加入41.1克TMP，室溫反應(yīng)50分鐘， DMF洗滌3次，DCM和甲醇輪換洗滌3次。
[0024]實(shí)施例3，參照?qǐng)D1，氨基樹(shù)脂替代度為0.8mmol/g，偶聯(lián)劑DIC/HOBt，其余同實(shí)施例 1〇
[0025]實(shí)施例4,參照?qǐng)D1，偶聯(lián)劑PyBOP/HOBt，其余同實(shí)施例1。
[0026]實(shí)施例5，參照?qǐng)D1，偶聯(lián)劑TBTU/HOBt，其余同實(shí)施例1。
[0027] 實(shí)施例6，參照?qǐng)D 1，主肽鏈 Fmoc-Ile-Gln(Trt)