一種百日咳桿菌培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細菌培養(yǎng)基技術領域，涉及一種百日咳桿菌培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]百日咳是引起全球嬰幼兒死亡的一個重要原因。據(jù)WHO報道，2008年全球百日咳發(fā)病約1600萬例，其中95%發(fā)生在發(fā)展中國家，約19.5萬兒童因此死亡。在我國，從近幾年的全國法定傳染病疫情通報中可看出每年都有2000人左右發(fā)病。
[0003]百日咳是由百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis)通過飛沫從感染者傳播給易感個體引起的。數(shù)十年來，通過使用質量可靠的百日咳疫苗對嬰幼兒開展免疫接種，在全球范圍內成功預防了嬰幼兒中出現(xiàn)嚴重的百日咳病例。2008年，全球約82%的嬰幼兒接種了3針次百日咳疫苗。WHO報道，2008年全球通過接種百日咳疫苗，避免了約68.7萬例死亡。
[0004]我國的國家免疫規(guī)劃中已將無細胞百白破聯(lián)合疫苗代替了全細胞的百白破疫苗。傳統(tǒng)的全細胞疫苗由于其較嚴重的副作用和無細胞百白破疫苗快速發(fā)展后展現(xiàn)出的巨大優(yōu)勢而逐漸被停用。無細胞百日咳疫苗(APV)自身具有免疫效果好且副反應小的優(yōu)點IHO推薦的無細胞疫苗包括PT、FHA(絲狀血凝素)、PRN、F頂2和FHO五種抗原，其中，百日咳毒素(PT)為APV的主要成分。理想的百日咳疫苗應是由抗原成分明確、具有良好的免疫原性及保護效果而無毒性作用的百日咳抗原組成。
[0005]而百日咳疫苗生產廠家一般均采用將百日咳菌種開啟到包姜氏培養(yǎng)基(含羊血成分)，再傳活性炭培養(yǎng)基(含牛源的酸水解酪蛋白)，最后接種SS培養(yǎng)基(或改良的SS培養(yǎng)基)，改良SS培養(yǎng)基可能會含有牛源的酸水解酪蛋白。這些在培養(yǎng)基中加入的動物血液成分和動物來源的氮源成分均存在潛在的感染動物攜帶病毒的風險，而且成分復雜，給疫苗帶來不安全的風險。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為無動物源成分、完全避免了因動物攜帶病原體給疫苗安全帶來的風險，提高了疫苗的安全性，減少疫苗接種的副反應。
[0007]本發(fā)明通過下述技術方案來實現(xiàn)。一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、5-8g谷氨酸鈉、4_8g植物蛋白胨、l_2g氯化鈉、0.1-0.2g硫酸鎂、2_3g L-胱氨酸、
0.2-0.3g煙酸、0.5-lg抗壞血酸、5-10g還原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeS04.7H20、20_40g蘆薈膠、25-35g瓊脂、4-5g橄欖油、5-10g青稞提取物。
[0008]百日咳桿菌培養(yǎng)基的最佳配比為:由以下原料組成:100ml水、6g谷氨酸鈉、6g植物蛋白胨、Ig氯化鈉、0.2g硫酸鎂、2g L-胱氨酸、0.3g煙酸、Ig抗壞血酸、8g還原型谷胱甘肽、1.0gFeS04.7H20、30g蘆薈膠、30g瓊脂、4g橄欖油、1g青稞提取物。
[0009]應用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟:
S1.菌種開啟:啟開百日咳工作種子批菌種，接種于固體培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)60小時； 52.傳二代培養(yǎng):將步驟SI開啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，35 °C培養(yǎng)25小時，為二代菌種菌液；
53.傳三代培養(yǎng):將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，35 °C培養(yǎng)25小時，為三代菌種菌液；
54.發(fā)酵罐培養(yǎng):將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為50小時，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為7.0?7.5，0D600值為5.0?10，將發(fā)酵液下罐，通過分離純化制備百日咳抗原。
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明的百日咳桿菌培養(yǎng)基作為無動物源成分，是用蘆薈膠，采用植物氮源，在培養(yǎng)基中添加使用橄欖油和抗壞血酸是培養(yǎng)基穩(wěn)定性提高，并增加青稞提取物作為百日咳桿菌繁殖的養(yǎng)分，提高培養(yǎng)效率，能在菌種傳代時進行良好的菌種復蘇和擴增培養(yǎng)，產毒亦可達到行業(yè)標準，因此本發(fā)明培養(yǎng)基完全避免了因動物攜帶病原體給疫苗安全帶來的風險，提高了疫苗的安全性，可以減少疫苗接種的副反應。
【具體實施方式】
[0011]下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0012]實施例1
一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、5g谷氨酸鈉、4g植物蛋白胨、Ig氯化鈉、0.1 g硫酸鎂、2g L-胱氨酸、0.2g煙酸、0.5g抗壞血酸、5g還原型谷胱甘肽、
0.5gFeS04.7H20、20g蘆薈膠、25g瓊脂、4g橄欖油、5g青稞提取物。
[0013]實施例2
一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、8g谷氨酸鈉、8g植物蛋白胨、2g氯化鈉、0.2g硫酸鎂、3g L-胱氨酸、00.3g煙酸、Ig抗壞血酸、I Og還原型谷胱甘肽、1.0gFeS04.7H20、40g蘆薈膠、35g瓊脂、5g橄欖油、1g青稞提取物。
[0014]實施例3
一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、6g谷氨酸鈉、6g植物蛋白胨、Ig氯化鈉、0.2g硫酸鎂、2g L-胱氨酸、0.3g煙酸、Ig抗壞血酸、8g還原型谷胱甘肽、1.0gFeS04.7H20、30g蘆薈膠、30g瓊脂、4g橄欖油、I Og青稞提取物。
[0015]實施例4
一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、5g谷氨酸鈉、8g植物蛋白胨、2g氯化鈉、0.1g硫酸鎂、2g L-胱氨酸、0.3g煙酸、0.5g抗壞血酸、1g還原型谷胱甘肽、
0.5gFeS04.7H20、25g蘆薈膠、35g瓊脂、5g橄欖油、6g青稞提取物。
[0016]實施例5
一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成:100ml水、8g谷氨酸鈉、4g植物蛋白胨、Ig氯化鈉、0.1g硫酸鎂、3g L-胱氨酸、0.2g煙酸、0.5g抗壞血酸、8g還原型谷胱甘肽、1.0gFeS04.7H20、35g蘆薈膠、25g瓊脂、5g橄欖油、5g青稞提取物。
[0017]實施例6 應用實施例3所述培養(yǎng)基培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，它包括以下步驟:
51.菌種開啟:啟開百日咳工作種子批菌種，接種于固體培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)60小時；
52.傳二代培養(yǎng):將步驟SI開啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，35 °C培養(yǎng)25小時，為二代菌種菌液；
53.傳三代培養(yǎng):將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，35 °C培養(yǎng)25小時，為三代菌種菌液；
54.發(fā)酵罐培養(yǎng):將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為50小時，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為7.0?7.5，0D600值為5.0?10，將發(fā)酵液下罐，通過分離純化制備百日咳抗原。
[0018]采用本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)比較實驗，本發(fā)明的培養(yǎng)基菌落增長更快，更均勻，培養(yǎng)基保存時間也更長，本發(fā)明的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)發(fā)酵液中PT含量、FHA含量顯著高于采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的PT含量、FHA含量。
【主權項】
1.一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:由以下原料組成:1000ml水、5-8g谷氨酸鈉、4-8g植物蛋白胨、l_2g氯化鈉、0.1-0.2g硫酸鎂、2-3g L-胱氨酸、0.2-0.3g煙酸、0.5_lg抗壞血酸、5-1 Og還原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeS04.7H20、20_40g蘆薈膠、25_35g瓊脂、4_5g橄欖油、5-1 Og青稞提取物。2.根據(jù)權利要求1所述的一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:由以下原料組成:100ml水、6g谷氨酸鈉、6g植物蛋白胨、Ig氯化鈉、0.2g硫酸鎂、2g L-胱氨酸、0.3g煙酸、Ig抗壞血酸、8g還原型谷胱甘肽、1.0gFeS04.7H20、30g蘆薈膠、30g瓊脂、4g橄欖油、1g青稞提取物。3.—種培養(yǎng)百日咳桿菌的方法，其特征在于，采用權利要求1或2所述的百日咳桿菌培養(yǎng)基，包括以下步驟: S1.菌種開啟:啟開百日咳工作種子批菌種，接種于固體培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)60小時； S2.傳二代培養(yǎng):將步驟SI開啟的百日咳菌種接種于二代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，35 °C培養(yǎng)25小時，為二代菌種菌液； S3.傳三代培養(yǎng):將二代菌種菌液接種于三代搖瓶液體培養(yǎng)基中，起始0D600值為0.2，.35 °C培養(yǎng)25小時，為三代菌種菌液； S4.發(fā)酵罐培養(yǎng):將三代菌種菌液接種于發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為50小時，培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為7.0?7.5，0D600值為5.0?10，將發(fā)酵液下罐，通過分離純化制備百日咳抗原。
【專利摘要】本發(fā)明屬于細菌培養(yǎng)基技術領域，涉及一種百日咳桿菌培養(yǎng)基，由以下原料組成：1000ml水、5-8g谷氨酸鈉、4-8g植物蛋白胨、1-2g氯化鈉、0.1-0.2g硫酸鎂、2-3g？L-胱氨酸、0.2-0.3g煙酸、0.5-1g抗壞血酸、5-10g還原型谷胱甘肽、0.5-1.0gFeSO4·7H2O、20-40g蘆薈膠、25-35g瓊脂、4-5g橄欖油、5-10g青稞提取物。本發(fā)明是用蘆薈膠，采用植物氮源，在培養(yǎng)基中添加使用橄欖油和抗壞血酸是培養(yǎng)基穩(wěn)定性提高，并增加青稞提取物作為百日咳桿菌繁殖的養(yǎng)分，提高培養(yǎng)效率。
【IPC分類】C12N1/20, C12P21/02, C12R1/01
【公開號】CN105624065
【申請?zhí)枴緾N201610110294
【發(fā)明人】何美娟, 藍海軍
【申請人】藍海軍
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月29日