一種rab7a和egfp基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及到RAB7A基因和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋 白慢病毒載體的構建，具體涉及一種RAB7A基因和EGFP過表達融合綠色熒光蛋白慢病毒載 體及其構建和在細胞自噬和內吞過程中功能研究。
【背景技術】
[0002] Rab家族是一類RAS相關的EGTP結合蛋白，對囊泡轉運的調節(jié)有重要作用。Rab 蛋白作為囊泡運輸?shù)姆肿娱_關，其功能是與上游調控子和下游特定的效應子相互作用，并 與GTP的結合和水解過程相偶聯(lián)，在囊泡的形成、轉運、錨定、融合等過程中起重要作用。
[0003]Rab7 屬Rab蛋白家族（Ras-likprotininratbrain,Rab)，具有介導晚期胞內 體與溶酶體的膜融合，參與晚期蛋白轉運到溶酶體過程的特定生物學功能，Rab7通過促進 溶酶體的運輸還可以清除胞內病毒，Rab7除了調控內吞過程的晚期運輸外，還參與了受體 的轉運，如將血管緊張素6受體1A，表皮生長因子受體轉運到溶酶體降解，受體所在的位 置決定著信號輸出的結果。因此，推測Rab7可能在信號轉導過程中發(fā)揮重要作用。
[0004]Rab蛋白通過與上游調控子和下游特定的效應子相互作用，它們能夠在GTP結合 的活性形式和GDP結合的非活性形式之間轉換，從而調控囊泡轉運的各個環(huán)節(jié)，如囊泡的 形成、運動、錨著以及融合過程。Rab蛋白的突變或表達異常會引起囊泡運輸異常，導致一些 疾病的產(chǎn)生。近年來，越來越多的研究表明，Rab蛋白參與了囊泡運輸和釋放及天然免疫應 答，還廣泛參與了信號轉導的過程。另有研究表明，Rab蛋白參與的調控囊泡轉運與其參與 的信號轉導存在著必然的聯(lián)系，Rab蛋白的定位與它們的功能密切相關。作為定位在晚期內 體或者溶酶體的Rab7,它的功能與內吞體的晚期運輸密切相關，盡管許多實驗目前都支持 Rab7參與了晚期內吞過程，但其中的詳細機制還不清楚。目前，Rab7的效應分子中研究的 比較透徹的是Rab7相關溶酶體蛋白（Rab7_intractinglysosomalprotin，RILP)。主要存 在于細胞內晚期內體/溶酶體結構。Rab7除了在內吞過程晚期的蛋白轉運發(fā)揮作用外，還 與信號轉導、細胞凋亡以及抗原遞呈等生理過程高度相關。Rab7本身的基因突變可引起遺 傳性疾病。另外，Rab7與病原體逃逸、腫瘤發(fā)生、脂質累積癥高度相關。因此，研究Rab7的 結構及其功能。闡明其在胞內發(fā)揮作用的機理，不僅有助于揭示疾病發(fā)生的機制，而且可能 為感染性疾病、腫瘤等疾病的治療提供科學依據(jù)。
[0005] 慢病毒是一種分子生物學中對基因功能研究常見的工具質粒，能高效轉染原核以 及真核細胞，使細胞能夠合成并且表達目的基因，通過對比目的基因在細胞內表達與否或 者表達強度，實現(xiàn)對目的基因在細胞甚至機體功能中的作用進行驗證和分析。因此，慢病毒 在研究基因在細胞及機體功能中的應用極為廣泛。由于Rab7存在于自噬體和晚內吞體膜 上，是自噬體和內吞體成熟所必需的共享分子之一，能導引胞內貨物沿微管運輸，最后參與 自噬體和內吞體與溶酶體的融合過程，目前認為該分子是調控自噬和內吞的關鍵分子。因 此如何直觀、有效地觀察RAB7A基因的表達及其在細胞自噬與內吞的變化顯得極為重要。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的：在現(xiàn)有技術條件下，本發(fā)明第一個目的在于解決RAB7A基因研究中所 需要的過表達載體，并提供EGFP基因和RAB7A基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載 體；本發(fā)明的第二個目的在于提供EGFP和RAB7A基因過表達慢病毒載體構建方法，能通過 EGFP的綠色熒光蛋白來示蹤RAB7A蛋白的定位及表達；本發(fā)明的第三個目的在于提供這種 過表達載體的應用范例。本發(fā)明構建的EGFP和RAB7A基因過表達的融合綠色熒光慢病毒 載體，解決了RAB7A基因研究中過表達載體高效和直觀等問題，該載體以CMV為啟動子，能 夠保證真核基因高效表達，采用EGFP為標記物，能夠通過直觀觀察表達熒光的強弱來判斷 細胞發(fā)生自噬和內吞的程度以及RAB7A基因在細胞缺氧過程中的作用，為研究RAB7A基因 的功能提供了良好的工具，為后續(xù)的RAB7A的相關研究提供基礎。在本發(fā)明中，RAB7A基因 和EGFP基因過表達融合綠色熒光慢病毒載體被轉入HK-2細胞（腎小管上皮細胞）和293T 細胞。通過RAB7A和EGFP的位置以及熒光程度反映在HK-2細胞自噬和內吞的程度。
[0007] 技術方案：為實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種RAB7A和EGFP 基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，把EGFP基因和RAB7A基因通過搭橋PCR的方 法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷 酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟 動子后面按照5'到3'方向插入EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。 RAB7A基因在細胞發(fā)生自噬和內吞過程中發(fā)揮重要作用，觀察其表達水平可判斷細胞發(fā)生 自噬和內吞的程度。
[0008] 上述的一段核苷酸序列如SEQIDN0 :1 所示。SEQIDNO:1 :TCCGGACTCAGATCT。 上述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體的構建方法，包括如 下步驟：在EGFP基因的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物，在RAB7A基因3'端 引入限制性內切酶酶切位點引物，用兩對引物擴增EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因 的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物和在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶 切位點引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR 反應完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基 因片段，最后EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。 [0009] 具體構建步驟如下：
[0010] 1)提取人的腎小管上皮細胞（HK-2)總的RNA，以逆轉錄的CDNA為模板，PCR擴增 RAB7A基因片段，所用引物：RAB7F:ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R:TCAGCAACTGCAGCTITCT， 將1. 5 %瓊脂糖凝膠回收得到PCR產(chǎn)物導入PMD18-T載體，測序驗證RAB7A基因的核苷酸順 序；
[0011] 測序結果與NCBI上的人的RAB7A基因序列進行比對。
[0012] 2)以PEGFP-C1的載體為模板擴增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切 位點，擴增EGFP基因。1.5%瓊脂糖凝膠回收，所用引物：
【主權項】
1. 一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，其特征在于，把 EGFP基因和RAB7A基因融合通過搭橋PCR的方法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段 核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體 LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟動子后面按5'到3'方向插入EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體，其特征在于，所述一段核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 權利要求1或2所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病 毒載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：在EGFP基因的5'端設計含有限制性內切 酶酶切位點的引物，在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶切位點引物，用兩對引物擴增 EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物 和在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶切位點引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR反應完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收 EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，最后將EGFP基因片段+ -段核苷酸序 列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 提取人的腎小管上皮細胞總的RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，PCR擴增RAB7A基因 片段，所用引物：RAB7F: ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R: TCAGCAACTGCAGCITTCT，將 PCR 產(chǎn) 物導入PMD18-T載體，測序驗證RAB7A基因的核苷酸順序； 2) 以PEGFP-C1的載體為模板擴增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切位 點，擴增EGFP基因； 所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B1R ：AGAGGTCATAGATCTGAGTCCGGACTTGTAC； 3) 以RAB7A基因為模板，擴增RAB7基因同時在B2R的引物3'端引入酶切位點EcoRI， 所用引物： B2F ：CTCAGATCTATGACCTCTAGGAAGAAAGTGT ； B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 4) 用搭橋PCR的方法擴增EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A序列，用B1F和B2R引物，以 步驟2)和步驟3)所得到的產(chǎn)物為模板擴增獲得EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A的兩個基 因連接在一起的序列，所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 5) 通過BamHI和EcoRI為酶切位點，將EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A基因的序列連 接到LV11載體上，并通過驗證得到RAB7A和EGFP過表達的融合綠色熒光蛋白的重組質粒。
5. 權利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體 在研究細胞自噬與內吞以及RAB7A基因功能中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種RAB7A基因和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白慢病毒載體及其構建方法和應用。本發(fā)明載體以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11載體的CMV啟動子后面按5’到3’方向插入EGFP基因和RAB7A基因片段，本發(fā)明構建的EGFP和RAB7A基因過表達的融合綠色熒光蛋白慢病毒載體，解決了RAB7A基因研究中過表達載體有效和直觀等問題。該載體以CMV為啟動子，能夠保證真核基因高效表達；采用EGFP為標記物，能夠通過直觀觀察表達熒光的強弱來判斷細胞發(fā)生自噬和內吞的程度以及RAB7A基因在細胞缺氧過程中的作用，為研究RAB7A基因的功能提供了良好的工具，為后續(xù)的RAB7A的相關研究提供基礎。
【IPC分類】C12N15-867, C12N15-66, C12Q1-68
【公開號】CN104531762
【申請?zhí)枴緾N201410765155
【發(fā)明人】余文敏, 陳平圣, 王智, 丁粉干, 劉靜, 劉蕾
【申請人】東南大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月12日