一種培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、提取物及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、提取物及 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液凝固（blood coagulation)是指血液由流動(dòng)的液體狀態(tài)變成不能流動(dòng)的凝膠 狀態(tài)的過程，是生理性止血過程的重要環(huán)節(jié)。血液凝固的實(shí)質(zhì)就是血漿中的可溶性纖維蛋 白原轉(zhuǎn)變成不溶性的纖維蛋白的過程。當(dāng)形成的纖維蛋白交織成網(wǎng)時(shí)，可把血細(xì)胞及血液 的其他成分網(wǎng)羅在內(nèi)，從而形成血凝塊。血液凝固是一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，需要多種 凝血因子的參與。凝血酶原的激活是在凝血酶原酶復(fù)合物作用下進(jìn)行的。因此，凝血過程可 分為凝血酶原酶復(fù)合物的形成、凝血酶原激活和纖維蛋白生成Ξ個(gè)基本過程。凝血酶原酶 復(fù)合物的形成有內(nèi)源性凝血和外源性凝血兩條途徑。
[0003] 內(nèi)源性凝血途徑，當(dāng)血液與帶負(fù)電荷的膠原蛋白（皮膚血管外壁)或異體表面(如 高嶺±、玻璃等)接觸時(shí)，因子Μ就由酶原激活成Ma，后者除能激活因子XI外，又同時(shí)使血 漿前緩激膚釋放酶激活。激活后的激膚釋放酶在高分子量激膚原的促進(jìn)下反過來又進(jìn)一步 使因子Μ激活，但此時(shí)不再是接觸激活而是膚鍵水解激活，使成為因子Mf。運(yùn)是一正反饋 效應(yīng)，不論Ma或Mf都具有相同的活力。激活后的Ma在化存在下接著又使因子Κ激活?；?化的因子Ka在Ca2+與憐脂存在下與因子Μ形成復(fù)合物，使因子X激活為因子Xa。激活后的 因子X與化2+、憐脂及因子V共同形成一復(fù)合物，后者最終使凝血酶原激活為凝血酶?；罨?的凝血酶能使可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的纖維蛋白。本次采用的體外試管法測定凝 血活性，原理也即家兔全血接觸玻璃試管后，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血通路，最終導(dǎo)致血凝塊的形 成。
[0004] 外源性凝血途徑，體內(nèi)組織損傷時(shí)釋放出因子虹，也稱為組織因子。在化存在下 它能與血液中已活化的因子Μ形成復(fù)合物，就能使因子X激活，此后就與內(nèi)源性激活途徑 的反應(yīng)步驟相同。通過外源性途徑血液凝固在10多秒鐘內(nèi)即可完成，而通過內(nèi)源性途徑則 需數(shù)分鐘。
[0005] 銀杏葉中含有天然活性黃酬及苦內(nèi)醋等與人體健康有益的多種成份，具有溶解膽 固醇，擴(kuò)張血管的作用，對(duì)改善腦功能障礙、動(dòng)脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、 記憶力減退等有明顯效果。其防病、治病、健身的價(jià)值在明代《本草綱目》中早有記載。經(jīng)國 家衛(wèi)生部口檢測證明：飲用銀杏茶可明顯降低血清膽固醇、甘油Ξ脂和低密度血脂蛋白，減 少體內(nèi)膽存脂肪的作用。對(duì)于高血脂的調(diào)節(jié)、高血壓和冠屯、病等屯、腦血管系統(tǒng)疾病患者輔 助性防治W及肥胖型人群的減肥等有良好的功效，是預(yù)防治療老年癡呆的理想飲品。是目 前世界公認(rèn)的治、防屯、腦血管疾病最理想的藥物成份。
[0006] 猴頭菌絲體中的活性物質(zhì)最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內(nèi)外對(duì)猴頭多糖的研 究表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強(qiáng)巨隧細(xì)胞的吞隧功能，促進(jìn)溶血 素的形成，抗白細(xì)胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭菌多糖備 受人們關(guān)注，成為近年來分子生物學(xué)、醫(yī)藥、食品科學(xué)等領(lǐng)域研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)。
[0007] 生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"是指利用菌絲體(包括真菌）的代謝功能，使有機(jī)物分解的生物 化學(xué)反應(yīng)過程。W適宜的培養(yǎng)基為營養(yǎng)，通過菌絲體的生長代謝和生命活動(dòng)產(chǎn)生豐富的次 生代謝產(chǎn)物。借鑒中醫(yī)藥組方思想，將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥作為部分培養(yǎng) 基進(jìn)行菌絲體轉(zhuǎn)化，目的是產(chǎn)生新化合物、增強(qiáng)功效或者降低單一藥物不良作用。
[0008] 據(jù)文獻(xiàn)查詢，猴頭菌絲體未有抗凝血作用。銀杏葉斂肺，平喘，活血化疲，止痛，用 于肺虛咳喘，冠屯、病，屯、絞痛，高血脂，抗凝固，有一定概率提高記憶力。
[0009] 中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?00710190182.3的專利申請(qǐng)公開了一種猴頭菌轉(zhuǎn)化銀杏葉提 取物的制備方法及用途，W猴頭菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得到具有降 低血糖的猴頭菌發(fā)酵液;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10-40g^，教皮l-5g/l，蛋白腺2-lOg/ 1，玉米粉5-20g/l，MgS〇4 · 7出0 0-lg/l和憐酸二氨鐘0.1-2g/l，碳酸巧l-10g/l，0.2-5%的 EGB，發(fā)酵培養(yǎng)的條件是:溫度為20-35°C，攬拌速率80-200巧m，初始抑為4.0-7.5，通氣量 0.1:1-2:1。其用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物或保健品。
[0010]猴頭菌轉(zhuǎn)發(fā)銀杏葉提取物(EGB化藝條件的研究，食品科學(xué)，2007，Vol. 28，No. 10， 公開了猴頭菌轉(zhuǎn)化EGB的最適pH為6.0，溫度為27 °C，EGB添加量為0.5 %，無需采用補(bǔ)加工 藝。在20L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，猴頭菌轉(zhuǎn)化EGB的最佳工藝條件為7化前通氣量為化/min， 7化后為4.化/min,轉(zhuǎn)速為12化/min。其發(fā)酵培養(yǎng)基(單位:g/L)為:教皮10,玉米粉10,葡萄 糖20，蛋白腺4，憐酸二氨鐘1.2，硫酸儀0.6。
[0011] 上述兩篇文獻(xiàn)中載明的都是猴頭菌轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物的技術(shù)，一方面，銀杏葉提 取物的價(jià)格相比銀杏葉更貴，另一方面，轉(zhuǎn)化后得到的產(chǎn)物主要用于降血糖和抑制非酶糖 基化反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、提取物及用 途，所述提取物的制備方法簡單，成本較低，產(chǎn)物用于制備抗凝血藥物。
[0013] 本發(fā)明所述培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0014] 麥教490~350份，玉米面140~100份，谷慷63~45份，白糖7~5份，銀杏葉300~ 500份，水400~600份。
[0015] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0016] 麥教420份，玉米面120份，谷慷54份，白糖6份，銀杏葉400份，水500份。
[0017] 本發(fā)明還提供一種生物轉(zhuǎn)化菌絲體，制備方法為:將猴頭菌類菌株接種至所述的 培養(yǎng)基中，在20~27Γ下，猴頭菌培育30~40天，烘干，得到生物轉(zhuǎn)化菌絲體。
[0018] 本發(fā)明的猴頭菌為猴頭菌科真菌猴頭菌巧ericium e;rinaceum(Bull .ex Fr.) Pers.) 〇
[0019] 所述生物轉(zhuǎn)化菌絲體是猴頭菌科真菌猴頭菌化ericium e;rinaceum(Bul 1. ex 化.化ers.)的菌絲體與其附生含有銀杏葉成份的固體培養(yǎng)基的干燥混合物。
[0020] 本發(fā)明還提供一種提取物，制備方法為：
[0021 ] (1)將生物轉(zhuǎn)化菌絲體進(jìn)行水提，50-70°C下用水浸泡，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌絲 體重量的6~10倍，得到提取液；
[0022] (2)將上述提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在50-70°C條件下抽真空干 燥，得到提取物。
[0023] 優(yōu)選的，水浸泡或抽真空干燥的溫度為60°C。
[0024] 本發(fā)明還提供一種提取物在制備抗凝血藥物或保健食品中的用途。
[0025] 猴頭菌絲體具有較弱抗凝血作用，銀杏葉的抗凝血活性在加工過程中大大損失。 猴頭菌是一種藥用真菌，能很好地吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)，徹底轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，產(chǎn)生新的活性物質(zhì) 及代謝物，為此，本發(fā)明將銀杏葉加入到培養(yǎng)基中，并對(duì)培養(yǎng)基的組分和含量進(jìn)行調(diào)配，猴 頭菌對(duì)銀杏葉進(jìn)行中藥菌絲體轉(zhuǎn)化，得到新的菌絲體，本發(fā)明對(duì)所得的生物轉(zhuǎn)化菌絲體進(jìn) 行提取，得到的提取物進(jìn)行了體外抗凝血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提樣品WAPTT為評(píng)價(jià)指標(biāo)，體 外抗凝血作用由強(qiáng)到弱為:生物轉(zhuǎn)化菌絲體>銀杏葉藥材S猴頭菌絲體>空白對(duì)照，皿轉(zhuǎn) 化物體外抗凝血活性比銀杏葉藥材高5.548倍;比猴頭菌絲體高7.137倍。該生物轉(zhuǎn)化菌絲 體提取物能顯著增加凝血活性，具有顯著的抗凝血作用，因此可應(yīng)用于制備抗凝血藥物或 保健食品。
[0026] 本發(fā)明低溫水浸泡生物轉(zhuǎn)化菌絲體，在50-70°C下水浸泡，無溫度破壞，既能溶解 有效成分但又不破壞有效成分;50-70°C減壓濃縮，不會(huì)破壞有效成分，特別是活性酶類物 質(zhì);為了不影響有關(guān)活性物質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選采用60°C條件下抽真空干燥。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1
[0028] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0029] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教490g、玉米面140g、谷慷63g、白糖7g，W及中藥材銀杏葉粗粉 (銀杏葉)300g，混勻，加入約500g水拌勻，即得培養(yǎng)基。再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在27°C條 件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)40天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0030] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，60°C水浸泡2次，每次浸泡2小時(shí)，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的6倍；
[0031] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0034] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教420g、玉米面120g、谷慷54g、白糖6g，W及中藥材銀杏葉粗粉 (銀杏葉)400g，混勻，加入約500g水拌勻，即得菌絲體培養(yǎng)基;再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 20°C條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)35天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0035] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，60°C水浸泡3次，每次浸泡3小時(shí)，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的8倍；
[0036] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0039] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教350g、玉米面lOOg、谷慷45g、白糖5g，W及中藥材銀杏葉粗粉 (銀杏葉）500g，混勻，加入約500g水拌勻，即得菌絲體培養(yǎng)基;再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 25 Γ條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0040] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，50°C水浸泡3次，每次浸泡4小時(shí)，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的10倍；
[0041] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在70°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0042] 實(shí)施例4
[0043] 銀杏葉滲入比例對(duì)比試驗(yàn)
[0044] 猴頭菌絲體生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)已經(jīng)很成熟，原料投料W干料計(jì)，比率固定為:麥 教70%、玉米粉20%、谷慷9%、白糖1 %，本發(fā)明把中藥材銀杏葉作為培養(yǎng)基之一，中藥材銀 杏葉參入的比率分別占30%、40%、50 %，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，總投料5000g，分別按上述實(shí)施例 1、實(shí)施例2、實(shí)施例3配制培養(yǎng)基，加水混勻、滅菌、接種、培養(yǎng)，平行對(duì)照，培養(yǎng)條件完全一 致，培養(yǎng)過程中觀察菌絲體生長狀況、生長周期、污染情況、生長速度，挖瓶后烘干稱重計(jì)算 收率，檢測樣品中的纖維素酶、麥角醬醇含量(考察轉(zhuǎn)化是否徹底）、銀杏總黃酬醇巧含量、 祗類內(nèi)醋含量，干燥后的樣品分別標(biāo)注為狀-1、狀-2、狀-3。試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下表：
[0045] ____
[0046] 試驗(yàn)結(jié)果表示:銀杏葉占50%