專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及單克隆抗體、抗體人源化等生物技術(shù)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的一種用于抗體培養(yǎng)基及其制備方法和用途，更具體地說(shuō)是涉及一種單克隆抗體培養(yǎng)基及其制備方法和用途，再具體地說(shuō)是涉及一種用于抗CD20單克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)抗CD20單抗)培養(yǎng)基及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
(一)抗⑶20單克隆抗體的研究概況
1、概述
腫瘤的死亡率在全世界各種疾病的死亡率居榜首，惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和生命的殺手。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)，每年有300余萬(wàn)新發(fā)惡性腫瘤患者，其中130 萬(wàn)人死于惡性腫瘤。在美國(guó)，每年診斷為腫瘤的患者為100萬(wàn)，死于腫瘤的患者達(dá)54. 7萬(wàn)， 用于腫瘤的治療費(fèi)用1020億美元。資料顯示，今后10年抗腫瘤生物技術(shù)藥物會(huì)急劇增加， 2007年美國(guó)共有400余種新藥在進(jìn)行抗腫瘤的臨床試驗(yàn)，其中生物技術(shù)類(lèi)產(chǎn)品占接近一半，可見(jiàn)，生物技術(shù)類(lèi)抗腫瘤藥物在腫瘤的防治中具有十分重要的意義。
非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma,或稱(chēng)非何杰金氏淋巴瘤,簡(jiǎn)稱(chēng)NHL) 是常見(jiàn)惡性血液病之一，且是臨床最常見(jiàn)的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，是由B淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)B細(xì)胞)惡性增長(zhǎng)引起的(B細(xì)胞來(lái)源約占85%)，好發(fā)于青壯年。近年來(lái)，NHL發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。本發(fā)明研究的CD20單抗是治療非何杰金氏淋巴瘤的一線(xiàn)藥物，是世界上銷(xiāo)售量最大的抗體之一，2010年全 球銷(xiāo)售額達(dá)到66億美元。
B淋巴細(xì)胞是體液免疫的起點(diǎn)，大部分的造血惡性腫瘤起源于此。因此，由B細(xì)胞和其對(duì)應(yīng)惡性腫瘤表達(dá)的細(xì)胞表面分子是免疫治療的重要靶標(biāo)。MS4A基因家族的B細(xì)胞特異成員⑶20在未成熟和成熟B細(xì)胞以及其對(duì)應(yīng)的惡性腫瘤表達(dá)(Tedder and Engel (1994) Immunol. Today 15:450-454)ο近年來(lái)針對(duì)多種惡性腫瘤表面細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物的靶向性治療取得巨大進(jìn)步，應(yīng)用單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤的臨床結(jié)果取得重大進(jìn)展，使得針對(duì)CD20的單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤成為發(fā)展前景良好的一種新型抗腫瘤方法。
2、CD20
目前抗CD20單克隆抗體是治療B淋巴瘤的最有效的治療藥物，在治療NHL中有極其重要的地位。⑶20是一種分子量為33 37kD的磷酸化蛋白質(zhì)分子，是B淋巴細(xì)胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴細(xì)胞表面，即B淋巴細(xì)胞表面分化抗原，而在其他組織以及多能B淋巴干細(xì)胞均不表達(dá)。它主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)起重要作用，⑶20從前-B淋巴細(xì)胞階段開(kāi)始表達(dá)，直到漿細(xì)胞階段才無(wú)⑶20表達(dá)(Stashenko p. , Nsdler LM, Hardy R, et al. Characterization of a human B lymphocyte-specific antigen. J.1mmun. 1980 ；125 :1678_1685)。CD20 和抗 CD20 抗體結(jié)合后不發(fā)生內(nèi)吞作用， 因而細(xì)胞表面CD20數(shù)量并不因?yàn)榭贵w的結(jié)合而減少，在人體血清中無(wú)游離的CD20存在。 ⑶20抗原高表達(dá)于超過(guò)95%的正?；驉夯腂淋巴瘤細(xì)胞，沒(méi)有顯著內(nèi)吞和脫落(PressOff,FarrAG,Borroz KI et al. Endocytosis and Degradation of Monoclonal Antibodies Targeting Human B-Cell Malignancies. Cancer Resl989 ；49 :4906-4912),因此CD20是治療B淋巴細(xì)胞瘤的理想靶點(diǎn)。
3、CD20基因的表達(dá)與調(diào)控
⑶20是B細(xì)胞的重要分化抗原，首先在前-B細(xì)胞中表達(dá)。成熟的B細(xì)胞也表達(dá) ⑶20，B細(xì)胞激活將產(chǎn)生⑶20的高表達(dá)，激活的扁桃體B細(xì)胞上的⑶20可以被沉降下來(lái)， 而靜態(tài)的扁桃體B細(xì)胞卻不能，生發(fā)中心B細(xì)胞上的CD20分子也表現(xiàn)為高表達(dá)。熒光分析證實(shí)，處于生長(zhǎng)進(jìn)化的B細(xì)胞均為⑶20高表達(dá)。B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化時(shí)，⑶20的表達(dá)為下降趨勢(shì)，⑶20在漿細(xì)胞中不表達(dá)。人⑶20基因?yàn)閱慰截惢?，位于染色體llql2. 13. 1，長(zhǎng) 16kb，有8個(gè)外顯子，其中外顯子I含有轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，外顯子III含有翻譯的起始位點(diǎn)， 外顯子VmRNA在剪接時(shí)會(huì)被剪切下來(lái)，外顯子VIII編碼⑶20分子mRNA的3'端非翻譯區(qū)。 ⑶20分子的mRNA以三種形式存在第一種mRNA長(zhǎng)2. 8kb，含有外顯子I到外顯子VIII的完整序列，這種mRNA為主要存在形式；第二種mR2NA由于外顯子I和外顯子III的剪接作用而缺少外顯子II，所以在長(zhǎng)度上比前者短263bp ;第三種mRNA長(zhǎng)3. 4kb，可能是外顯子I 上游的某一段序列參與了外顯子I內(nèi)部的剪接而產(chǎn)生的，這種形式的mRNA較少。⑶20的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，PU.1和Pip是最重要的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，二者均結(jié)合在⑶20的啟動(dòng)子區(qū)，只有結(jié)合了 Pip和PU.1的啟動(dòng)子才具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能。CD20的啟動(dòng)子沒(méi)有TATA 框，轉(zhuǎn)錄需要一個(gè)保守序列——NF2Y結(jié)合位點(diǎn)，約占啟動(dòng)子的30%。B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞時(shí)，CD20 和 PU.1 的水平均下降(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。 ⑶20的表達(dá)因淋巴瘤細(xì)胞的不同而有所差異，例如⑶20在慢性B淋巴白血病細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)低于正常的B細(xì)胞和其他B淋巴瘤細(xì)胞，⑶20的表達(dá)高低在一定程度上決定了抗體和補(bǔ)體殺傷瘤細(xì)胞的程度(Perz J等，Leuk Lymphoma, 2002，43 (I) : 149-151 )。細(xì)胞的生長(zhǎng)因子能夠調(diào)節(jié)一些瘤細(xì)胞中 CD20 的表達(dá)(Golay J 等，Blood, 2001，98(12) : 3383-3389)。IL24、 TNF2 a、GM2CSF上調(diào)慢性B淋巴白血病細(xì)胞的⑶20的表達(dá)，Sivaraman等發(fā)現(xiàn)慢性B淋巴白血病細(xì)胞與 500u/ml的IFN2 α作用24小時(shí)后，細(xì)胞表面的⑶20分子明顯增加，作用72 小時(shí)CD20增加的程度低于24小時(shí)，這說(shuō)明這種刺激作用經(jīng)歷一個(gè)峰值后將隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。Morikawa等發(fā)現(xiàn)，抗⑶5抗體的加入可以使膜⑶20的數(shù)量下降，這說(shuō)明⑶5可能也參與了 CD20 表達(dá)的調(diào)節(jié)(Morikawa K 等，Scand J Im munol, 2002，55 (I) :44-52)。亦有研究表明離子射線(xiàn)也可持續(xù)上調(diào)CD20的表達(dá)。
4、CD20分子的功能
⑶20的生理作用至今尚未闡明，根據(jù)⑶20與抗⑶20的抗體結(jié)合后B細(xì)胞產(chǎn)生的一系列的生物學(xué)反應(yīng)，推測(cè)CD20可能參與B細(xì)胞的增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣離子的跨膜傳遞?？笴D20的抗體對(duì)B細(xì)胞增殖的影響因抗體種類(lèi)而異，抗體IF5可刺激B細(xì)胞由GO期進(jìn)入Gl期，而抗體BI抑制B細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S/G2+M期?？耿?0的抗體還抑制B細(xì)胞的分化和EB病毒誘導(dǎo)Ig的分泌。CD20的胞內(nèi)區(qū)與酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶為非共價(jià)結(jié)合，⑶20與抗⑶20結(jié)合將激活這些激酶，誘導(dǎo)PLC Y的磷酸化。同時(shí)上調(diào)C2myc 和B2myb的mRNA水平，增加⑶18、⑶58和MHCII家族蛋白的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明， CD20是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞生命與分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子?？笴D20的抗體可直接抑制B細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，該凋亡的發(fā)生與鈣離子相關(guān)。細(xì)胞中鈣離子濃度低時(shí)，細(xì)胞沿循細(xì)胞周期生長(zhǎng)，CD20與抗體交聯(lián)形成后，在漿膜上形成鈣離子通道，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加，抑制B細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S/G2+M期，從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生(Shan D et al. Cancer I mmu no Im munother, 2000，48 (12) : 73-76)。二級(jí)抗體(如羊抗人抗體)或表達(dá) FcRI β 細(xì)胞可增強(qiáng)上述B細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，該凋亡與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加和PTK及其底物的磷酸化有著密切關(guān)系(Bt ephan M 等，Cancer Res, 2000，60:7170-7176)。實(shí)驗(yàn)證明，CD20 與抗CD20抗體及二級(jí)抗體的超級(jí)結(jié)合能夠啟動(dòng)并增強(qiáng)PTK信號(hào)通路，底物PLC Y的磷酸化程度與CD20的交聯(lián)程度有密切依賴(lài)關(guān)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存鈣的釋放使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度快速增加，同時(shí)胱天蛋白酶(caspase)發(fā)生活化。對(duì)于耐藥的B細(xì)胞瘤，⑶20與抗⑶20抗體的結(jié)合增加活性氧的爆發(fā)(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。以上說(shuō)明CD20分子本身是一個(gè)鈣泵，CD20的激活是調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣離子變化的又一個(gè)影響因素， 并通過(guò)鈣離子變化直接調(diào)節(jié)鈣離子通道活性。
5、抗⑶20單克隆抗體研究進(jìn)展
多數(shù)的人B細(xì)胞譜系惡性腫瘤表達(dá)CD20 (Anderson等，Blood, 198463 :1424)。 基于抗⑶20嵌合體或放射標(biāo)記單克隆抗體的療法已經(jīng)用于非霍奇金淋巴瘤(Press 等，Hematology，2001，221-240 ;Kaminski 等，N. Engl. J. Med. 1993329:459-465)。 臨床研究表明抗CD20單克隆抗體治療hia改善類(lèi)風(fēng)濕性該關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜和溶血性貧血以及其他免疫介導(dǎo)的疾病臨床表現(xiàn)(Sliverman等，Arthritis Rheum. , 2002, 48:1484-1492;Enwards 等，Rheumatology,2001, 40:1-7)。
應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性假設(shè)解釋抗⑶20單克隆抗體的體內(nèi)(in vivo)治療效果。在一個(gè)模型中，⑶20作為膜整合的靶標(biāo)用于通過(guò)天然免疫系統(tǒng)的活化或效應(yīng)子機(jī)制的啟動(dòng)產(chǎn)生單克隆抗體介導(dǎo)的 B 細(xì)胞消除(Reff 等,Blood, 1994, 83:435-445;Maloney 等 Blo od, 1998,90 2188-2195;Maloney 等，J. Clin. Oncol. 1997，15:3266-3274)。
目前，經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市用于治療NHL的抗CD20的單抗有Rituximab、Zevalin, Bexxar等，Rituximab (利妥昔單抗，商品名美羅華；后簡(jiǎn)稱(chēng)美羅華)是第一個(gè)是上市的抗 CD20的單克隆抗體類(lèi)藥物，是一種嵌合體人IgGl抗人CD20單克隆抗體，能高效誘導(dǎo)補(bǔ)體 (C)激活的經(jīng)典途徑和對(duì)新鮮分離的淋巴瘤細(xì)胞和B細(xì)胞系的補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(RefT 等，Blood, 1994，83 :435-445 ；Golay 等，Blood, 98 :3383-3389 ；Cragg 等 Blood, 2003，101 1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003, 171:1581-1587;Bellosillo 等，Blood, 2001, 98:2771-2777)。美羅華還在病人(van der Klok 等，Br. J. Hematol. 2001，115:807-811) 和靈長(zhǎng)類(lèi)(Kennedy等，Blood，2003，101 :1071-1079)體內(nèi)激活補(bǔ)體。此外，包括CD59在內(nèi)的補(bǔ)體調(diào)解蛋白的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和抗⑶20治療的抗性相關(guān)(Golay等，Blood, 98 3383-3389 ;Treon 等 J.1mmunotheraphy，200124:263-271 )。雖然許多人認(rèn)為補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性是美羅華在體外(i η V i tr ο )和體內(nèi)消除人淋巴瘤細(xì)胞中所使用的主要用途(Go I ay 等，Blood，98 :3383-3389 ;Cragg 等 Blood，2003，101 :1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003，171:1581-1587;Golay 等，Blood,95 :3900-3908 ；Di Gaetano 等 J. Hematol. 2001，11 4:800-809;Weiner Blood2003,101 :788)，但是其他人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)裂解的易感性以及補(bǔ)體抑制劑CD46、CD55和CD59在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)不能預(yù)測(cè)美羅華的治療效果(Weng和Levy，Blood，2001，98 :1352_1357)。因?yàn)榕c臨床使用的同種型不同的嵌合體抗CD20單克隆抗體不能在非人或靈長(zhǎng)類(lèi)中消除正常的B細(xì)胞(Anderson等,Biochem. Soc.Transac.，1997，25 =705-708),并且抗CD20單克隆抗體的抗腫瘤效應(yīng)部分地依賴(lài)通過(guò)IgG 的Fe受體(Fe Y R)的免疫激活(Clynes等,Nature Med. ,2000,6 :443-446),所以其他的抗體依賴(lài)作用也是重要的。此外，抗⑶20單克隆抗體處理改變了跨膜Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和B細(xì)胞功能，這些擾亂了細(xì)胞周期進(jìn)程(Tedder和Engel, Immunol. Today, 1994, 15:450-454)并且能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡(Shan等，Blood, 1998，91 :1644_1652)。
單獨(dú)使用美羅華治療復(fù)發(fā)以及難治的非霍奇金淋巴瘤有效率達(dá)50%左右，若與化療藥物聯(lián)用，則有效率可達(dá)909^100%。同時(shí)，美羅華會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)，諸如脫發(fā)、 惡心、嘔吐、血細(xì)胞減少等，且有輕微的發(fā)熱、寒顫等。但美羅華仍由其在治療非霍奇金淋巴瘤上表現(xiàn)的良好療效和低毒副作用，已成為美國(guó)銷(xiāo)售額最大的抗腫瘤藥物之一，2008年銷(xiāo)售額近30億，年增長(zhǎng)率14%。
但這些藥物治療費(fèi)用較高，致使中國(guó)很多患者難以接受治療。因此，研究療效好、 治療成本低的藥物對(duì)提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活質(zhì)量具有重大意義。此外，研發(fā)對(duì)人免疫原性更小，表達(dá)量更高，以及具有其他優(yōu)良特性的抗CD20單克隆抗體或多克隆抗體， 更成為目前的研究重點(diǎn)。
(二)真核細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)
自20世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來(lái)，基因表達(dá)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。并隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃實(shí)施的進(jìn)行，在技術(shù)方法上得到了很大發(fā)展，時(shí)至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明。利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。 其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對(duì)比較低廉。但與此同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法 對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。
為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點(diǎn)是
a)根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無(wú)同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；
b)能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及；
c)能?chē)?yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開(kāi)關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量。
因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
1、酵母表達(dá)系統(tǒng)
最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來(lái)人們又相繼開(kāi)發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris 應(yīng)用最多。
甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因-1 (簡(jiǎn)稱(chēng)A0xl)，在該基因的啟動(dòng)子(簡(jiǎn)稱(chēng)PAX0I)作用下，外源基因得以表達(dá)。PAXOI 是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，在以葡萄糖或甘油為碳源時(shí)。甲醇酵母中AOxl基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)PAXOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá)，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E. coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E. coli復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)志,可在獲得克隆后采用E. coli細(xì)胞大量擴(kuò)增.目前，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。
利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時(shí)，一般需很長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險(xiǎn)性化工產(chǎn)品。使得實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(簡(jiǎn)稱(chēng)GAP)啟動(dòng)子代替PAX0I，不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需更換碳源，操作更為簡(jiǎn)便，可縮短外源蛋白到達(dá)峰值水平的時(shí)間。
酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。
2、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(簡(jiǎn)稱(chēng)=AcNPV)作為表達(dá)載體。在AcNPV感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)蛋白表達(dá)能力，故常被用來(lái)構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒。克隆入外源基因的傳遞質(zhì)粒與野生型AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細(xì)胞中不能形成包涵體，利用這一特點(diǎn)可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞但效率比較低，且載體構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，一般需要4 6周。此外，昆蟲(chóng)細(xì)胞不能表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲(chóng)細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，與目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學(xué)工作者先后嘗試用絲蛾肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或桿狀病毒ie-Ι基因啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等(Farrel等， Biotech, and Bioeng. ,1998,60 (6) :656-663)介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括3個(gè)調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列(l)Bombyx mori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子； (2)Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie_l (編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子)；(3) BmNPV的同源重復(fù)序列3 (HR3)可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應(yīng)用于昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，該病毒由AcNPV及Bni’ qP發(fā)展而來(lái)。
一般情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個(gè)問(wèn)題將Hsp70 (熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達(dá)可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因?yàn)榉置谛远嚯谋环g后必須到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工才能被分泌至胞外。如果到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前，前體多肽就伸展開(kāi)來(lái)，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對(duì)最終的表達(dá)水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，從而提高蛋白的分泌水平。
最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅 S2細(xì)胞，以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞(如sf9、sf21)中復(fù)制，不能在其他昆蟲(chóng)細(xì)胞(如果蠅細(xì)胞)中復(fù)制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動(dòng)子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體利用的是果蠅啟動(dòng)子如Hsp70啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等，其中，Hsp70啟動(dòng)子的作用最強(qiáng)。重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全， 表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個(gè)領(lǐng)域中。
3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等。
將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞主要通過(guò)2類(lèi)方法一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過(guò)脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸·鈣共沉淀法及DEAE —葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。外源基因的體外表達(dá)一般采用質(zhì)粒表達(dá)載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞可建立高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，而利用COS細(xì)胞可建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當(dāng)大(約187kb)，利用它作為載體可同時(shí)插入幾種外源基因，從而構(gòu)建多價(jià)疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過(guò)其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體，具有潛在的危險(xiǎn)性。
由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類(lèi)病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴(lài)于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會(huì)大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線(xiàn)性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過(guò)CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入IaxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)Cre 介導(dǎo)兩個(gè)IaxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們?cè)跅U狀病毒中插入巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲(chóng)病毒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)引起病毒基因的表達(dá)，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移為發(fā)明人提供了很好的途徑。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動(dòng)子有關(guān)如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達(dá)特異性差； 當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)表達(dá)有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對(duì)細(xì)胞造成損傷等。
為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負(fù)調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子(簡(jiǎn)稱(chēng)fIA)的序列，在沒(méi)有四環(huán)素或強(qiáng)力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達(dá)。隨后Gossen等又對(duì)tTA的氨基酸序列進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒(méi)有四環(huán)素的情況下啟動(dòng)子不被激活，而在加入四環(huán)素或強(qiáng)力毒素后目的基因高效表達(dá)(Gossen 等，Science, 1995，268 (5218) :1766-1769 ；Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1992,89(12):5547-5551)。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
外源蛋白的表達(dá)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，一個(gè)主要問(wèn)題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達(dá)。Mielke等(Mielke等，Gene, 2000,254 (1-2) :1_8)構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)， 在這個(gè)系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順?lè)醋觤RNA。 內(nèi)部的順?lè)醋油ㄟ^(guò)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(簡(jiǎn)稱(chēng)=IREs)介導(dǎo)進(jìn)行翻譯，通過(guò)持續(xù)選擇壓力，無(wú)需繁瑣的篩選過(guò)程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的重組體。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定。
利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿(mǎn)足大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動(dòng)物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項(xiàng)技術(shù)還不很成熟，有待進(jìn)一步研究。
由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)(Mielke等，Gene，2000，254 (1_2):1_8)。Vander Geld等利用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了蛋白激酶(簡(jiǎn)稱(chēng)PR30)，并對(duì)它們的抗原性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有與抗PR3抗體結(jié)合的所有表位，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表達(dá)的PR3只具有少數(shù)幾個(gè)表位(Vander Geld 等，J.1mmunol. Meth.，2000，244 (1-2) :117_132)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。因此，研發(fā)一種表達(dá)量更高，操作簡(jiǎn)便的哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，具有巨大的應(yīng)用空間；并且可以提供成本更低的基因工程類(lèi)藥物，具有巨大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
(三)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基
1、細(xì)胞培養(yǎng)基概述及優(yōu)缺點(diǎn)分析
細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的最重要因素。無(wú)血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類(lèi)培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無(wú)血清培養(yǎng)基是一種不含有動(dòng)物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、繁殖的一種培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基由于其組成成分相對(duì)清楚，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，在現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)也是闡明細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究問(wèn)題的有力工具。
常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的血清或組織提取物， 其中最常用于培養(yǎng)基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在以下缺點(diǎn)
(I)血清來(lái)自于動(dòng)物體，其對(duì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的主要作用是提供生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用，但同時(shí)也有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子和毒性因子，所以存在潛在毒性。、
(2)由于動(dòng)物血清提取的局限，使其應(yīng)用于培養(yǎng)基的價(jià)格格外昂貴。
(3)動(dòng)物血清提取的局限，也給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)困難，同時(shí)也存在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化難的問(wèn)題，具有潛在的細(xì)胞毒性作用，給規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞增加了難度(Even M S，Sandusky C B, Barnard N D. Serum free hydridoma culture : ethical, scientific and safety considerations[J] . Trendsin Biotechnology,2006, 24(3):105-108.)。
由于上述常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在的諸多問(wèn)題，促使發(fā) 明人改進(jìn)培養(yǎng)方法，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)替代。細(xì)胞工程中無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上可以避免含血清培養(yǎng)所帶來(lái)的不利。無(wú)血清培養(yǎng)基具有以下明顯的優(yōu)缺點(diǎn)
無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
①可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。
②避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。
③避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。
④有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。
⑤可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。
缺點(diǎn)
①細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。
②成本較高。
③針對(duì)性很強(qiáng)，一種無(wú)血清培養(yǎng)基僅適合某一類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)。
2、無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展概述
從1975年垂體細(xì)胞株Gh3在無(wú)血清介質(zhì)中生長(zhǎng)獲得成功到現(xiàn)在，無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展大致經(jīng)歷了 3代。
第I代無(wú)血清培養(yǎng)基不含血清，但含有大量成分不明確的動(dòng)、植物蛋白。因此，其不利于目標(biāo)蛋白的分離純化，成本也較高。
第2代無(wú)血清培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮而開(kāi)發(fā)的，其主要特點(diǎn)是完全不用動(dòng)物來(lái)源蛋白，稱(chēng)之為無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物衍生蛋白培養(yǎng)基。它的優(yōu)點(diǎn)是既可降低生產(chǎn)成本，又能加快報(bào)批的速度。
由于生物工程的要求，第3代無(wú)血清培養(yǎng)基近年已出現(xiàn)，即完全沒(méi)有蛋白或含量極低，組成成分全為化學(xué)已知物的培養(yǎng)基，稱(chēng)之為雙無(wú)培養(yǎng)基。其優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞培養(yǎng)與生產(chǎn)很容易做到恒定，目標(biāo)蛋白的分離純化更為容易，細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料成本大為下降，生產(chǎn)中品質(zhì)管理更加容易。但其對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞具有很高的特異性。
目前預(yù)測(cè)第4代無(wú)血清培養(yǎng)基將會(huì)進(jìn)入研究與開(kāi)發(fā)，這將是一種無(wú)血清、無(wú)蛋白、 又可以高溫消毒的適合于許多種不同細(xì)胞生長(zhǎng)的全能型培養(yǎng)基。小結(jié)可見(jiàn)表I (陳峰，無(wú)血清培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充印子及研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2006，18 (4):10-13)。
由上可知，第四代培養(yǎng)基的研制開(kāi)發(fā)并投入市場(chǎng)將成為發(fā)展趨勢(shì)。
表1、無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展過(guò)程
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該培養(yǎng)基是無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子構(gòu)成；所述的補(bǔ)充因子由無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、氨基酸、維生素、其他物質(zhì)組成，其含量分別為 O. ΟΟΓΟ. 9%、0· ΟΟΓΟ. 035%,O. ΟΟΓΟ. 06%,O. 00Γ0. 4%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)是包括無(wú)水氯化鈣、七水硫酸亞鐵、氯化鉀、氯化鎂、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、無(wú)水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或七水硫酸鋅中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、 L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門(mén)冬酰胺、L-天門(mén)冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-纈氨酸中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的維生素是包括硫辛酸、維生素H、D-泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、i_肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺或維生素B12中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的其他物質(zhì)是包括D-葡萄糖、 次黃嘌呤、酚紅或胸苷等中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基的制造流程為(1)稱(chēng)取所有成分；(2)溶解于10升純水中，攪拌溶解；(3)無(wú)菌過(guò)濾，即為成品無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基作為培養(yǎng)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞的具體步驟包括(1)在本發(fā)明所述的無(wú)血清培養(yǎng)基中接種CHO細(xì)胞；(2)在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)CHO細(xì)胞一段時(shí)間，即得所述的CHO細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的適合生長(zhǎng)的條件是 37±2°C, 5± 1% 二氧化碳,所述的一段時(shí)間是1-3周。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該CHO細(xì)胞用于制備抗 CD20單克隆抗體，其制備方法包括如下步驟(O構(gòu)建一個(gè)獨(dú)特的PMED高效哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)；(2)建立一個(gè)懸浮細(xì)胞、無(wú)血清培養(yǎng)馴化體系，通過(guò)轉(zhuǎn)染將⑶20單抗基因整合到CHO 細(xì)胞的基因組中，通過(guò)逐步增加MTX的濃度使整合在細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白基因拷貝數(shù)大量擴(kuò)增，篩選CHO細(xì)胞亞克隆，獲得高表達(dá)工程細(xì)胞株，并建立三級(jí)種子細(xì)胞庫(kù)；(3)建立適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，使用該無(wú)血清CD培養(yǎng)基培養(yǎng) CHO工程細(xì)胞株；(4)建立哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及蛋白純化體系，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模發(fā)酵及純化平臺(tái)，獲得外源蛋白的大規(guī)模表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該抗CD20單克隆抗體的有關(guān)測(cè)定情況如下(1)N端氨基酸序列測(cè)定測(cè)序結(jié)果為 Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的美羅華一致；(2)C端搭配序列測(cè)定測(cè)序結(jié)果為 Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的美羅華一致；(3)肽圖分析肽譜與對(duì)照品美羅華一致；(4)分子量測(cè)定測(cè)得的分子量還原型介于6317KD，非還原型約為150KD，與對(duì)照品及文獻(xiàn)報(bào)道的美羅華一致；(5)等電點(diǎn)測(cè)定測(cè)得的等電點(diǎn)分布在4. 8±0. 5內(nèi)，與對(duì)照品及文獻(xiàn)報(bào)道的美羅華一致。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的CHO工程細(xì)胞株是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO DG44。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗CD20單抗培養(yǎng)基及其制備方法和用途。該培養(yǎng)基是一種無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子構(gòu)成，補(bǔ)充因子由無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、氨基酸、維生素、其他物質(zhì)組成。該培養(yǎng)基上清用于培養(yǎng)基因工程CHO細(xì)胞，用于制備價(jià)格昂貴的蛋白質(zhì)藥物如抗CD20單抗、促紅細(xì)胞生成素、干擾素等。該培養(yǎng)基具有成本低、細(xì)胞培養(yǎng)密度大(可達(dá)9x106/L)、活力高、蛋白高表達(dá)(可達(dá)到3g/L)及易純化等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響，同時(shí)可以降低細(xì)胞培養(yǎng)液的成本，提高生物制品成品率和利潤(rùn)率，適于醫(yī)藥、生物技術(shù)領(lǐng)域等工業(yè)和行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用，應(yīng)用前景良好，具有顯著的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102994441SQ20121035281
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者宋華, 白文, 肖鐘熙 申請(qǐng)人:上海瀚康生物醫(yī)藥科技有限公司